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選擇雜交瘤細胞及抗體檢測2012/10/24

1．HAT選擇雜交瘤細胞脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理后形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養液中培養時，由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤*核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞含有上述兩種酶，在HAT選擇培養液中可以生長繁殖。用HAT選擇培養1～2d內將有大量瘤細胞死亡，3—4d后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落。HAT選擇培養液維持7一tod后應換用HT培養液，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底l／10面積時，

UV滅活載體噬菌體的制備2012/10/24

[器材和試劑]●XL1-B1ue或者DHF’TB細胞●f1R1噬菌體●TB●TBS（tris緩沖鹽水；50mmol/LTris-HCLpH7．6,150mmol/LNaCl，0．05％硫柳汞）●PEG/NaCl溶液（20％PEG，2，5mol/LNaCl）●皮氏培養皿，直徑150mm（Falcon）●UVStratalinker2400（Stratagene）●硫柳汞（Sigma）[方法]1．用來自備存材料的或直接取自一個噬菌斑的f1Rl噬菌體，其濃度大約為109個噬菌斑形成單位（pfu），感染

用抗人抗體包被微珠2012/10/24

[器材和試劑]●磁珠（DynabeadsM-450，甲苯磺酰活化，Dynal）●硼酸鹽緩沖液（50mmol/L硼酸鈉，pH9．5）每抗人Fc多克隆抗體（免疫純的羊抗人IgGFc片段特異性抗體，Pierce）●磁分離器（Dynal）●PBS（磷酸鹽緩沖液：2mmol/LNaH2PO4H20，16mmol/LNa2HPO4·2H20，15mmol/LNaCl）●PBBS（PBS，0．1％BSA）●硫柳汞（Sigma）[方法]1．將500ul已充分混懸的磁珠轉移到1支Eppendorf管中。將該管置于

標準品的制備、鑒定、計量2012/10/24

1．標準品的制備：標準品的制備是非常復雜的問題，也是標記免疫分析中比較難于制備的一個成分。以下討論的是實驗室標準品（或商品化試劑中標準品）的制備。1）基質的制備：如前所述，作為標準品的介質（基質）成分應與被測樣品相同。對大多數用于測定血清中某物質的標準品，應用不含被測物質的零血清制備，以求反應的介質環境相當。但有時零值血清的制備十分困難，所以有些標準品用適當的緩沖液制備，并在緩沖液中加入一定量的載體蛋白（一般用1%～2%的牛血清白蛋白），以便使其與樣品的介質環境相近。零值血清的制備方法有：（1）

雜交瘤技術的基本原理2012/10/24

雜交瘤抗體技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠B細胞和小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養基中生長（選擇原理見后），小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養基的作用下，只有B細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交才具有持續增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆。其原理從下列3個主要步驟闡明。（一）細胞的選擇與融合建立雜交瘤技術的目的是制備對抗原特異的單克隆抗體

為何使用標記蛋白2012/10/24

標記蛋白具有許多優點。原則上，該方法為檢測各種細胞成分中感興趣的蛋白提供廠新的手段。①如果開放閱讀框已經被克隆化，但是由于蛋白是新發現的，或者由于蛋白免疫原性較弱，目前尚沒有針對該蛋白產物的抗體時，此標記技術具有重要的應用價值。隨著基因組的研究，由基因工程進入蛋白工程，標記技術顯得越來越重要。②由于標記物不是天然蛋白氨基酸序列的固有部分，與標記物結合的試劑在進行蛋白提純過程中，對蛋白功能產生影響的可能性較小。③只要具備適當的載體，標記蛋白可在任何細胞中進行表達；例如，相同的標記蛋白既可在細菌中表

影響標記蛋白的主要因素2012/10/24

該系統的主要影響因素是因在蛋白上引入標記物可導致蛋白生物活性改變，因為標記的結果，本質上是制造了一個由目的蛋白和標記物氨基酸序列融合而成新的蛋白。因此，使用該技術時，應該認識到是研究新的蛋白特性，而不是研究蛋白的原來特性。但實踐經驗表明這并不成為很大的問題，通過標記蛋白獲得的信息可以采用針對原始未標記蛋白的抗體證實。第二方面的主要影響因素是在進行表位標記時，許多目前使用的標記物是由已知的蛋白（如myc基因產品）片段組成。這意味著抗標記物抗體不僅識別被研究的標記蛋白，同時還可能識別其他細胞蛋白，研

石蠟組織切片的制備2012/10/24

當尋找適用的方法時，請注意下述資料是10多年經驗的結晶。制備1升Bouin固定液：2g苦味酸溶于500ml去離子水中，濾過，在通風櫥中，加入20g多聚甲醛，加熱至60℃，加數滴lmol／LNaOH使其溶解；冷卻，加500ml2xPBS。大多數的組織學研究都采用多聚甲醛固定、石蠟包埋的組織標本。因此，此類來源的大多數的組織和器官，對抗原的定位可直接提供可靠的資料。組織學家和病理學家有豐富的組織學經驗，并且，對抗原表達模式的評價是很有價值的。如果固定和包埋過程粗糙，則許多抗原不能被很好地保存。固定的

巴貝蟲病實驗室診斷與結果分析2012/10/24

巴貝蟲病（Babesiosis）是由巴貝蟲通過蜱傳播引起的人畜共患性原蟲病，原蟲主要寄生于哺乳動物的紅細胞內。人巴貝蟲病的主要臨床表現有寒戰、發熱、貧血、黃疸、溶血和脾臟大等。[病因學]巴貝蟲通過蜱叮咬，使孢子進入人體，在紅細胞中進行裂體增殖為裂殖子。當感染嚴重時，可使大量紅細胞破壞，并釋出蟲體代謝產物，引起寒戰、高熱、溶血、黃疸、血紅蛋白尿。感染原蟲的紅細胞可相互黏聚，堵塞毛細血管發生缺血和壞死。常見的損壞器官是肝、腎、脾、心和腦。侵入紅細胞的裂殖子可發育為雌雄配子體，在蜱叮咬時配子體隨血進入

菜姆病實驗室診斷與結果分析2012/10/24

萊姆病（1ymedisease）又叫蜱傳螺旋體病，是蜱傳伯氏包柔螺旋體引起的、多系統損害的、自然疫源性傳染病。臨床表現復雜，通常以具有特征性的擴展性皮損起病，繼而出現神經系統、心臟及關節受損。[病因學]伯氏包柔螺旋體革蘭染色陰性，瑞氏—姬姆薩染色良好。病原體呈不規則盤卷狀，長1l～37um，直徑0．18—0．25um。對熱、干燥及化學消毒劑敏感，但耐潮濕和低溫。攜帶有病原體的蜱叮咬皮膚后，病原體在叮咬處形成原發浸潤灶，并向四周擴散呈環形紅斑狀。螺旋體入血后形成螺旋體血癥，其脂多糖具有內毒素的生物

回歸熱實驗室診斷與結果分析2012/10/24

回歸熱（relapsingfever）是由回歸熱螺旋體所致的急性傳染病，以反復發作的高熱，頭痛，全身肌肉疼痛及肝脾腫大為臨床特點，重癥患者還會有黃疸和出血傾向。根據傳播媒介不同將回歸熱分為虱傳回歸熱（流行性回歸熱）和蜱傳回歸熱（地方性回歸熱）。我國以虱傳型為主。[病因學]回歸熱螺旋體為疏螺旋體或包柔螺旋體屬，虱傳者為回歸熱螺旋體，蜱傳者有約10余種。螺旋體有4—20個稀疏不規則的螺旋，革蘭染色陰性，暗視野下運動活躍。螺旋體在特殊培養基及雞胚中可生長，對干燥、熱和多種化學消毒劑敏感，但耐寒。虱傳回

果蠅類標本的熒光標記試劑染色檢測操作步驟2012/10/24

（1）樣品洗畢，重懸于含1％正常羊IgG的PBS中。在1．5m1錐形管中胚胎或其他樣品所占體積應少于50fJl，或在5mlsnap-top管中應少于200fil。搖動孵育1h。在此方法中，以非免疫動物的羊IgG作為封閉劑，即從正常羊血清中通過蛋白G純化制備。因本文推薦的標記二抗是羊抗鼠（或兔）免疫球蛋白抗體，故選擇羊IgG作為封閉試劑。如使用的是另一來源的標記二級試劑，則應改用其他封閉劑，如可選用3％牛血清白蛋白。（2）用PBS洗樣品2次。（3）加一抗：用含蛋白質的溶液進行抗體稀釋。例如，用含1

PCR雜交梳法檢測淋病雙球菌2012/10/24

淋病是由淋病雙球菌亦稱淋病奈瑟菌所引起的急性或慢性泌尿生殖器系統的化膿性感染。主要通過性接觸傳染，女性也可由淋球菌污染的衣褲、浴巾、馬桶等感染而發生淋菌性陰道炎。常見檢測方法為PCR雜交梳法檢測淋球菌DNA。[測定方法]PCR雜交梳法[方法學原理]采用堿變性法對疑為淋球菌感染患者的生殖道分泌物或其他可疑樣本進行處理，釋放并提取其中的DNA。采用*標記引物對DNA進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳或雜交方法對擴增產物進行檢測。[標本準備]1．生殖泌尿道拭子將高壓滅菌的特制棉拭子伸人男性尿道口或女性宮頸口上

柯薩奇病毒抗體IgG（CXV Ab-IgG）檢測2012/10/24

[測定方法]ELISA法[方法學原理]在微孔板上預包被純化的柯薩奇病毒抗原，樣本中的CXVAb-IgG可與微孔板上抗原結合，加入酶標抗體后，與抗原抗體復合物結合，在顯色劑作用下顯色，顏色的深淺與樣本中抗體含量呈正相關。[標本準備]靜脈抽血2ml，不抗凝。[試劑]1．微孔板2．樣品稀釋液3．酶聯試劑4．陰性對照5．陽性對照6．洗滌劑7．TMB顯色液8．終止液[儀器設備]酶標儀或全自動酶聯免疫檢測儀。[測定步驟]1．取標本稀釋液100yl，加入反應孔內（陰性對照、陽性對照直接加入100ul對照血清）

酶聯法檢測梅毒螺旋體抗體2012/10/24

[檢測方法]ELISA法[方法學原理]用精制的基因工程表達的梅毒螺旋體特異性抗原包被固相載體，加患者血清后，如患者血清中有相應抗體，可形成抗原抗體復合物。在此基礎上加入酶標記抗原，即可形成抗原—抗體—酶標記復合物。再加入酶底物，底物經酶分解后顯色，即為陽性反應。反之，若患者血清中無相應抗體，則酶標記抗原就不能與包被抗原相結合，從而加入酶底物不會顯色，此為陰性反應。[標本準備]靜脈血2ml，不抗凝。[試劑]1．TP酶標板2．TP陽性對照3．TP陰性對照4．TP酶標試劑5．顯色劑A6．顯色劑B7．終

大腸桿菌的常規分離鑒定方法2012/10/24

在獸醫臨診或實驗中，需做分離鑒定的大腸桿菌多限于一些對畜禽有致病性的菌株，如引起初生幼畜（仔豬、犢牛、羔羊）兼或斷奶豬腹瀉的ETEC菌株、致豬水腫病和幼兔腹瀉以及雞各種大腸桿菌感染癥的病原性菌株。除對分離菌做生物化學分型鑒定和血清學分型鑒定外，還應包括對ETEC黏附素抗原和腸毒素的鑒定，對水腫病菌株的SLT-Ⅱ有條件時也可以進行測定。至于對雞、兔和豬水腫病的菌株的菌毛鑒定且前尚處于實驗室研究階段。1．形態和培養特征致水腫病和新生仔豬腹瀉的大多數菌株可呈溶血，在麥康凱瓊脂上形成紅色菌落，伊紅美藍瓊

大腸桿菌病流行病學特征2012/10/24

大腸桿菌病是指由致病性大腸桿菌引起多種動物不同疾病或病型的統稱，包括動物的局部性或全身性大腸桿菌感染、大腸桿菌腹瀉、敗敗癥和毒血癥等。各種動物大腸桿菌病的表現形式有所不同，但多發生于幼齡動物，給養殖業造成了嚴重的損失。大腸桿菌作為人和動物腸道正常菌系的主要成員在維持腸道正常生理機能上起著重要作用。雖多數菌株在腸內是非病原性或條件致病性的，但確有少數特定的血清型與人和動物大腸桿菌感染有關，有的血清型還具有廣泛的致病性，因此目前人們按照大腸桿菌致病力的大小將其分為致病性菌株、條件致病性菌株和非致病性

裂谷熱診斷技術-- PCR方法2012/10/24

RT-PCR已經用于蚊子和臨床樣品中RVFV的檢測。Sall等用RT-PCR對NS（S）蛋白編碼區進行序列分析，用于系統發育分析以鑒定病毒的兩個不同譜系，發現一個是埃及的，另一個是撒哈拉的，使得RT-PCR成為分子流行病學的有力工具。Ibrahim等從M節段的高度保守的區域設計了兩對PCR引物用于RT-PCR和巢式RT—PCR，所擴增的序列為G2糖蛋白基因的一部分。由于在GenBank中只能查到ZH—501和ZH—548M12毒株M節段的全序列，但是可以得到其他24株毒株的部分核苷酸序列；當這些

裂谷熱診斷技術--ELISA方法2012/10/24

直到2000年，裂谷熱只限定在非洲流行，但是近在阿拉伯半島致死性的暴發，表明需要快速診斷、有效地處理和預防這一疾病。該病由于沒有特征性的臨床癥狀，因此個別病例的診斷較為困難，但是該病具有以下流行特征：眾多動物流產，新生畜大批死亡，乃至人群發病。RVFV通常流行于非洲國家，流行常伴隨著特大降雨的周期循環，較少發生在半干旱地區（30—35年的周期），或者較頻繁（3～10年的周期）發生在較大雨量的草原地區。經典的檢測裂谷熱病毒抗體的參考方法是建立在多種形式的病毒中和試驗（VN）和血凝抑制試驗基礎上的，

核糖體P蛋白自身抗體2012/10/24

Francoeur和Elkon等人發現，SLE患者體內可查及針對三種蛋白質：核糖體磷酸蛋白P0、P1和P3的自身抗體。抗P抗體對SLE高度特異，并與精神癥狀相關。1．致病作用抗P和抗Sm抗體都與人SLE和SLE鼠模型（MRL／Lpr）相關，Sm抗體陽性的SLE患者和SLE模型鼠的陽性率分別為11％、6％。這可能與B細胞的非廣泛性激活有關，因為抗Sm、抗P抗體陽性鼠體內，總IgG、抗DNA或抗染色質抗體的濃度并不高。抗P與抗Sm之間的關系提示，這些抗原雖然位于不同的亞細胞結構中，但它們在抗體合成的