淋病是由淋病雙球菌亦稱淋病奈瑟菌所引起的急性或慢性泌尿生殖器系統(tǒng)的化膿性感染。主要通過性接觸傳染，女性也可由淋球菌污染的衣褲、浴巾、馬桶等感染而發(fā)生淋菌性陰道炎。常見檢測方法為PCR雜交梳法檢測淋球菌DNA。
[測定方法] PCR雜交梳法
[方法學(xué)原理] 采用堿變性法對疑為淋球菌感染患者的生殖道分泌物或其他可疑樣本進(jìn)行處理，釋放并提取其中的DNA。采用*標(biāo)記引物對DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳或雜交方法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
[標(biāo)本準(zhǔn)備]
1．生殖泌尿道拭子 將高壓滅菌的特制棉拭子伸人男性尿道口或女性宮頸口上1～2cm，旋轉(zhuǎn)1周，停留約10s后取出，將棉拭子頭放人盛有l(wèi)ml無菌生理鹽水的標(biāo)本冷凍保存管中，從頸部剪斷拭子，使拭子頭浸入鹽水中，反復(fù)漂洗。
2．初段尿標(biāo)本 取lml初段尿，在無菌離心管中15 000rpm離心15min，棄上清液。
[試劑]
1．DNA提取液
2．NGPCR反應(yīng)液
3．Taq DNA聚合酶
4．石蠟油
[儀器] PCR擴(kuò)增儀
[檢測步驟]
1．取生殖泌尿道拭子標(biāo)本、初段尿標(biāo)本、陰性對照，15 000rpm離心10min，棄上清液。沉淀中加入50u1 DNA提取液，使沉淀懸浮后100℃沸水浴15min，15 000rpm離心10min。處理后的樣品應(yīng)在1h內(nèi)使用，或在-20～-80℃長保存2周（不宜反復(fù)凍融）。
2．按樣本數(shù)n取NG PCR反應(yīng)液nX23ul、Taq酶nX 2ul混于一離心管中，用移液器混勻，按每管25u1分裝。（若不使用PCR儀的熱蓋功能，每管加入1滴石蠟油，防止管內(nèi)液體的揮發(fā)）。
3．將樣品處理上清液（凍存樣品使用前在室溫環(huán)境中融化，12 000rpm離心2min），試劑盒NG陽性對照（無需處理，可低速離心，劇烈振蕩混勻），先低速離心后用振蕩器混勻，各取5u!分別加入反應(yīng)管中，混勻，標(biāo)記后12 000rpm離心10s，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
4。將反應(yīng)管置于PCR儀上，先在37℃環(huán)境中反應(yīng)10min，然后在94℃環(huán)境中保溫5min，再按93℃45s—55℃45s—72℃60s循環(huán)35次，后在72℃環(huán)境中延伸5min。PCR反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)在1h內(nèi)進(jìn)行檢測；或?qū)CR反應(yīng)管一20℃保存，3d內(nèi)進(jìn)行檢測。
5．在PCR擴(kuò)增后的反應(yīng)管中加入5u1上樣緩沖液，充分混勻后取15ul下層藍(lán)色液體，經(jīng)含EB染色劑的2％瓊脂糖凝膠電泳30min（5V／cm），至藍(lán)色指示劑距離點樣孔1．5cm時結(jié)束電泳。將膠置于紫外檢測分析儀上觀察，若在390bp處出現(xiàn)橙黃色條帶（與陽性對照處于同一位置），則標(biāo)本中有淋病奈瑟菌核酸存在。
[臨床意義] 淋病奈瑟菌感染簡稱淋球菌感染，女性約有半數(shù)、男性也有一定數(shù)量為無癥狀帶菌者。淋球菌培養(yǎng)不易生長，通常做膿性分泌物涂片染色鏡檢，但不適用于無癥狀帶菌者。ELISA淋球菌抗原、抗體測定與鏡檢的一致率男性為98．8％、女性為87．8％；與細(xì)菌培養(yǎng)比較，敏感性、特異性分別為73％～100％和90％～100％。該法的優(yōu)點是抗原易于保存，轉(zhuǎn)送容易，適用于大批量的檢測和無癥狀帶菌者檢測，缺點是有效治療后淋球菌雖死亡但抗原性仍殘留；不能用于p內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生和藥物敏感性研究，同時淋球菌與奈瑟菌屬特別是腦膜炎球菌有共同抗原性，存在交叉反應(yīng)。PCR敏感性高，可檢測出3個淋球菌CFU，且特異性高。淋球菌抗體陽性表明感染過淋球菌。
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