蛋白質(zhì)含量的測(cè)定原理及操作方法！
蛋白質(zhì)含量的測(cè)定原理及操作方法！
百歐博偉生物 衡量食品的營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，要測(cè)定蛋白質(zhì)含量，但由于蛋白質(zhì)組成及其性質(zhì)的復(fù)雜性，在食品分析中，通常用食品的總氮量表示，蛋白質(zhì)是食品含氮物質(zhì)的主要形式，每一蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量，用實(shí)驗(yàn)方法求得某樣品中的含氮量后，通過一定的換算系數(shù)。即可計(jì)算該樣品的蛋白質(zhì)含量。
一般食品蛋白質(zhì)含氮量為l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其換算系數(shù)為6.25，小麥取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，動(dòng)物膠5.55。
一、目的與要求：
掌握微量凱氏法測(cè)定蛋白質(zhì)總氮量的原理及操作技術(shù)。包括樣品的消化，蒸餾吸收及滴定與含氮量的計(jì)算。
二、原理：
凱氏定氮法：食品經(jīng)加硫酸消化使蛋白質(zhì)分解，其中氮素與硫酸化合成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后，再用鹽酸或硫酸滴定根據(jù)鹽酸消耗量，再乘以一定的數(shù)值即為蛋白含量，其化學(xué)反應(yīng)式如下。
(1)2NH2(CH2)2COOH+13H2S04 (NH4)2S04+6C02+12S02+ 16H2
(2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4
(3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O
(4)(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2
三、試劑與儀器：
⒈硫酸鉀
⒉硫酸銅
⒊硫酸
⒋2％硼酸溶液
⒌40％氫氧化鈉溶液
⒍混合指示劑：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚綠溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基紅溶液2毫升混合而成．
⒎0.OINHCL標(biāo)準(zhǔn)溶液或0．01N硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液．
⒏凱氏微量定氮儀一套。
⒐定氮瓶100m1或50ml一只。
⒑三角瓶150ml 3只。
⒒量筒50ml、lOml、lOOml。
⒓吸量管10ml只。
⒔酸式滴定管1支。
⒕容量瓶100毫升1只。
⒖小漏斗1只。
四、操作方法：
⒈樣品處理：精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品（約相當(dāng)?shù)?0-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，3g硫酸鉀及20毫升硫酸，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45度角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上，小火加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫*停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5小時(shí)。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸銨同一方法做試劑空白試驗(yàn)。
⒉按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水約2/3處加甲基紅指示劑數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸，用調(diào)壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水。
⒊想接收瓶?jī)?nèi)加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應(yīng)室，并以10ml水洗滌小燒杯使流入反應(yīng)室內(nèi)，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應(yīng)室，立即將玻璃蓋塞緊，并加水于小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾，蒸氣通入反應(yīng)室使氨通過冷凝管而進(jìn)入接收瓶?jī)?nèi)，蒸餾5min。移動(dòng)接收瓶，使冷凝管下端離開液皿，再蒸餾1min，然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液定至灰色或藍(lán)紫色為終點(diǎn)。
同時(shí)吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。
計(jì)算：
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) +F*100
X：樣品中蛋白質(zhì)的含量，g；
V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml；
V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；
N：硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；
0.014：1N硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml相當(dāng)于氮克數(shù)；
m：樣品的質(zhì)量（體積），g（ml）；
F：氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。
注：
（1）樣品應(yīng)是均勻的，固體樣品應(yīng)預(yù)先研細(xì)混勻，液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。
（2）樣品放入定氮瓶?jī)?nèi)時(shí)，不要沾附頸上，萬一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不*，結(jié)果偏低。
（3） 消化時(shí)如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷后，慢慢加入30%過氧化氫2-3ml，促使氧化。
（4）在整個(gè)消化過程中，不要用強(qiáng)火，保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下。使氮有損失。
（5）如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失，這樣會(huì)形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當(dāng)硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時(shí)，要增加硫酸的量。
（6）加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點(diǎn)，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時(shí)作堿性反應(yīng)的指示劑。
（7）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨(dú)使用0.1%甲基紅乙醇溶液。
（8）氨是否*蒸餾出來，可用PH試紙?jiān)囸s出液是否為堿性。
（9）吸收葉也可以用0.01當(dāng)量的酸代表硼酸，過剩的酸液用0.01N堿液滴定，計(jì)算時(shí)，A為試劑空白消耗堿液數(shù)，B為樣品消耗堿液數(shù)，N為堿液濃度，其余均相同。
（10）以硼酸為氨的吸收液，可省去標(biāo)定堿液的操作，且硼酸的體積要求并不嚴(yán)格，亦可免去用移液管，操作比較簡(jiǎn)便。
（11）向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí)，往往出現(xiàn)褐色沉淀物，這是由于分解促進(jìn)堿與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時(shí)銅離子與氨作用，生成深蘭色的結(jié)合物[Cu(NH3)4]++
百歐博偉生物（biobw）是北京的一家專業(yè)于生物技術(shù)的研究與廣泛運(yùn)用及推廣的高科技公司，位于北京企業(yè)林立的豐臺(tái)區(qū)造甲街，生物技術(shù)推廣及運(yùn)用早于2011年開始，成立公司于2013年一月。本公司主要提供色譜耗材、色譜儀器、固相萃取裝置、化學(xué)試劑、樣品瓶、氘燈、標(biāo)準(zhǔn)品、微生物技術(shù)、菌種保藏服務(wù)以及ATCC產(chǎn)品代理等產(chǎn)品及服務(wù)。
