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蛋白質(zhì)含量的測(cè)定原理及操作方法!

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                         蛋白質(zhì)含量的測(cè)定原理及操作方法!



蛋白質(zhì)含量的測(cè)定原理及操作方法!


百歐博偉生物 衡量食品的營(yíng)養(yǎng)成分時(shí),要測(cè)定蛋白質(zhì)含量,但由于蛋白質(zhì)組成及其性質(zhì)的復(fù)雜性,在食品分析中,通常用食品的總氮量表示,蛋白質(zhì)是食品含氮物質(zhì)的主要形式,每一蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量,用實(shí)驗(yàn)方法求得某樣品中的含氮量后,通過一定的換算系數(shù)。即可計(jì)算該樣品的蛋白質(zhì)含量。

一般食品蛋白質(zhì)含氮量為l0%如肉、蛋、豌豆、玉米等,其換算系數(shù)為6.25,小麥取5.70,大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17,動(dòng)物膠5.55。


一、目的與要求:

掌握微量凱氏法測(cè)定蛋白質(zhì)總氮量的原理及操作技術(shù)。包括樣品的消化,蒸餾吸收及滴定與含氮量的計(jì)算。


二、原理:

凱氏定氮法:食品經(jīng)加硫酸消化使蛋白質(zhì)分解,其中氮素與硫酸化合成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨游離,用硼酸液吸收后,再用鹽酸或硫酸滴定根據(jù)鹽酸消耗量,再乘以一定的數(shù)值即為蛋白含量,其化學(xué)反應(yīng)式如下。

(1)2NH2(CH2)2COOH+13H2S04    (NH4)2S04+6C02+12S02+  16H2

(2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4

(3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O

(4)(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2


三、試劑與儀器:

⒈硫酸鉀

⒉硫酸銅  

⒊硫酸

⒋2%硼酸溶液

⒌40%氫氧化鈉溶液

⒍混合指示劑:把溶解于95%乙醇的0.l%溴甲酚綠溶液10毫升和溶于95%乙醇的0.l%甲基紅溶液2毫升混合而成.

⒎0.OINHCL標(biāo)準(zhǔn)溶液或0.01N硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液.

⒏凱氏微量定氮儀一套。

⒐定氮瓶100m1或50ml一只。

⒑三角瓶150ml 3只。

⒒量筒50ml、lOml、lOOml。

⒓吸量管10ml只。

⒔酸式滴定管1支。

⒕容量瓶100毫升1只。

⒖小漏斗1只。


四、操作方法:

⒈樣品處理:精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品(約相當(dāng)?shù)?0-40mg),移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中,加入0.2g硫酸銅,3g硫酸鉀及20毫升硫酸,稍搖勻后于瓶口放一小漏斗,將瓶以45度角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上,小火加熱,待內(nèi)容物全部炭化,泡沫*停止后,加強(qiáng)火力,并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸,至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后,再繼續(xù)加熱0.5小時(shí)。取下放冷,小心加20ml水,放冷后,移入100ml容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸銨同一方法做試劑空白試驗(yàn)。

⒉按圖裝好定氮裝置,于水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水約2/3處加甲基紅指示劑數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸,用調(diào)壓器控制,加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水。

⒊想接收瓶?jī)?nèi)加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應(yīng)室,并以10ml水洗滌小燒杯使流入反應(yīng)室內(nèi),塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯,提起玻璃塞使其緩慢流入反應(yīng)室,立即將玻璃蓋塞緊,并加水于小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾,開始蒸餾,蒸氣通入反應(yīng)室使氨通過冷凝管而進(jìn)入接收瓶?jī)?nèi),蒸餾5min。移動(dòng)接收瓶,使冷凝管下端離開液皿,再蒸餾1min,然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶,以0.01N硫酸或0.01N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液定至灰色或藍(lán)紫色為終點(diǎn)。

同時(shí)吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。

計(jì)算:

X =((V1-V2)*N*0.014)/( m*(10/100)) +F*100 

X:樣品中蛋白質(zhì)的含量,g;

V1:樣品消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積,ml;

V2:試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,ml;

N:硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度;

0.014:1N硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml相當(dāng)于氮克數(shù);

m:樣品的質(zhì)量(體積),g(ml);

F:氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

注:

(1)樣品應(yīng)是均勻的,固體樣品應(yīng)預(yù)先研細(xì)混勻,液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。

(2)樣品放入定氮瓶?jī)?nèi)時(shí),不要沾附頸上,萬一沾附可用少量水沖下,以免被檢樣消化不*,結(jié)果偏低。

(3) 消化時(shí)如不容易呈透明溶液,可將定氮瓶放冷后,慢慢加入30%過氧化氫2-3ml,促使氧化。

(4)在整個(gè)消化過程中,不要用強(qiáng)火,保持和緩的沸騰,使火力集中在凱氏瓶底部,以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下。使氮有損失。

(5)如硫酸缺少,過多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失,這樣會(huì)形成硫酸氫鉀,而不與氨作用,因此當(dāng)硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時(shí),要增加硫酸的量。

(6)加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點(diǎn),硫酸銅為催化劑,硫酸銅在蒸餾時(shí)作堿性反應(yīng)的指示劑。

(7)混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠,可單獨(dú)使用0.1%甲基紅乙醇溶液。

(8)氨是否*蒸餾出來,可用PH試紙?jiān)囸s出液是否為堿性。

(9)吸收葉也可以用0.01當(dāng)量的酸代表硼酸,過剩的酸液用0.01N堿液滴定,計(jì)算時(shí),A為試劑空白消耗堿液數(shù),B為樣品消耗堿液數(shù),N為堿液濃度,其余均相同。

(10)以硼酸為氨的吸收液,可省去標(biāo)定堿液的操作,且硼酸的體積要求并不嚴(yán)格,亦可免去用移液管,操作比較簡(jiǎn)便。

(11)向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí),往往出現(xiàn)褐色沉淀物,這是由于分解促進(jìn)堿與加入的硫酸銅反應(yīng),生成氫氧化銅,經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時(shí)銅離子與氨作用,生成深蘭色的結(jié)合物[Cu(NH3)4]++


百歐博偉生物(biobw)是北京的一家專業(yè)于生物技術(shù)的研究與廣泛運(yùn)用及推廣的高科技公司,位于北京企業(yè)林立的豐臺(tái)區(qū)造甲街,生物技術(shù)推廣及運(yùn)用早于2011年開始,成立公司于2013年一月。本公司主要提供色譜耗材、色譜儀器、固相萃取裝置、化學(xué)試劑、樣品瓶、氘燈、標(biāo)準(zhǔn)品、微生物技術(shù)、菌種保藏服務(wù)以及ATCC產(chǎn)品代理等產(chǎn)品及服務(wù)。






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