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PCR反應擴增DNA的原理

來源:上海撫生實業有限公司   2025年05月27日 13:52  
       先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈,然后加入一對根據已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物,即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴增的DNA片段,一般需20-30個堿基對,過少則難保持與DNA單鏈的結合。引物與互補DNA結合后,以靶DNA單鏈為模板,經反鏈雜交復性(退火),在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷(dNTP)為原料按5'到3'方向將引物延伸、自動合成新的DNA鏈、使DNA重新復制成雙鏈。然后又開始第二次循環擴增。引物在反應中不僅起引導作用,而且起著特異性的限制擴增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補序列,并又可作為下一輪聚合反應的模板。如此重復上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環過程,使每次循環延伸的模板又增加1倍,亦即擴增DNA產物增加1倍,經反復循環,使靶DNA片段指數性擴增。
 
  PCR的擴增倍數Y=(1+E)n,這里Y是擴增量,n為PCR的循環次數。E為PCR循環擴增效率。設PCR擴增效率E為100%、循環次數n=25次,靶DNA將擴增到33554432個拷貝,即擴增3355萬倍:若E為80%、n=20、則擴增數量將下降到1408865拷貝,即擴增產物約丟失93%,若E=100%,n=20,則擴增數量減少1048576個拷貝,擴增產物約減少97%。可見PCR循環擴增效率及循環次數都對擴增數量有很大影響。PCR擴增屬于酶促反應,所以,DNA擴增過程遵循酶促動力學原理。靶DNA片段的擴增最初表現為直線上升,隨著靶DNA片段的逐漸積累,當引物—模板/DNA/聚合酶達到一定比值時,酶的促化反應趨于飽和,此時靶DNA產物的濃度不再增加,即出現所謂平臺效應。PCR反應達到平臺期的時間主要取決于反應開始時樣品中的靶DNA的含量和擴增效率,起始模板量越多到達平臺期的時間就越短、擴增效率越高到達平臺期的時間也越短。另外酶的含量,dNTp 濃度,非特異性產物的擴增都對到達平臺期時間有影響。


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