1、引言
大豆多肽屬于生物活性肽，是以大豆蛋白為主要原料，經過提取分離、純化并精制而成的低聚肽的混合物(蛋白質水解物)，通常以由 3～6個氨基酸組成的小分子肽為主，還含有少量游離氨基酸、糖類、水分和無機鹽等。大豆多肽具有較高的營養價值，其氨基酸組成與大豆蛋白一樣，是一種理想的新型大豆深加工產品【1】。
大豆蛋白經酶水解后，其產物中含有多種生理活性肽小分子大豆肽不僅溶解性好、黏度低，而且在人體內消化吸收快。另外，還具有降血壓、降血脂、促進礦物質吸收、脂肪代謝、免疫調節、抗氧化、抗癌、抗輻射、減肥、調節血糖濃度、抗疲勞、低過敏性、促進微生物的生長發育和代謝等多種不同的生物活性【2】。
大豆蛋白酶水解產物在食品工業中一般應用于飲料、奶粉奶酪乳制品和代乳品中，也可添加在肉類食品和醋、醬油等發酵食品中，可以用來生產面條、饅頭、面包以及冷凍食品. 以顯著提高產品的品質和營養價值，并增強產品的口感風味【1】【2】。
《GB/T 22492-2008 大豆肽粉》為生產企業提供一個通用的產品質量規范，但對于大豆肽粉在大豆蛋白提取、酶解、發酵、肽的過膜分離（超濾、微濾、納濾）、色譜分離（液相、GPC）、脫色、脫苦等工藝控制環節沒有指導方法。
本文探索了豆粕蛋白酶解粗肽的反相液相色譜分析方法，操作簡便，通用性好，適用于質控環節，為液相色譜質譜聯用測序提供了先導方法。
2、樣品前處理
2.1試劑配制
流動相：取3mL色譜級甲酸加入1L色譜級乙腈中，無需抽濾，混勻超聲10min；取3mL色譜級甲酸加入1L超純水中，無需抽濾，混勻超聲10min。
2.2試劑配制
樣品配制：樣品為豆粕蛋白的酶解產物，未經過膜處理，多肽分子量分布很廣的粗品。分別稱取大豆肽1號2號3號試樣各20mg于三個2ml液相小瓶中，各加超純水1ml，渦旋1min，用0.22um尼龍66濾頭過濾，待用。
3、色譜條件
3.1儀器信息
儀器硬件：ThermoFisher Vanquish液相色譜儀
色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3.1；中藥指紋圖譜相似度評價軟件
3.2方法信息
色譜柱：Accucore Vanquish C18 2.1 mm×150 mm，1.5 μm（PN：27101-152130）
流動相：A：0.3%甲酸水溶液；B：0.3%甲酸乙腈溶液，
流速：0.2 mL/min，梯度程序見表1：
表1. 梯度洗脫程序
進樣量：2 µL
柱溫：30℃（still air模式）
檢測器波長：280nm
4、樣品分析譜圖及測定結果
4.1典型色譜圖
圖1a. 大豆肽1號樣品和空白色譜圖疊圖
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圖1b. 大豆肽1號224nm、280nm色譜圖及光譜信息
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4.2重復性
圖2. 大豆肽3號樣品六針連續進樣色譜、壓力疊圖
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表2. 大豆肽3號樣品六針連續進樣保留時間和峰面積穩定性數據
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4.3相似度評價
借助中藥指紋圖譜相似度評價軟件，可以比較兩個譜圖之間的差異，進而了解來料大豆肽的批次間差異，為指導工藝調整提供科學直觀依據。
圖3. 大豆肽1號、2號、3號指紋圖譜和相似度評價結果
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● 積分參數平滑為0.4，即加大平滑令色譜峰以峰組形式存在，數目相對減少時，以大豆肽3號為對照時，大豆肽1號的相似度為0.663，大豆肽2號的相似度為0.7。
● 針對復雜樣品，以峰組形式積分（結合平滑等參數），可以得到數目合適，又能覆蓋主要色譜峰的積分譜圖?；诖说脑u價結果才更為合理。
結果與討論
1、客戶樣品為豆粕蛋白酶解產物，未經過膜分離，多肽分子量分布跨度大，同時不排除混有糖、蛋白、氨基酸等其他化合物。若能將樣品通過超濾膜分離凈化，按照分子量范圍分成幾組肽段，分別建立液相方法，則借助液相做質控更科學嚴謹一些。
2、樣品前處理少，優勢在于快捷高效，成本低，適于工廠化驗室操作，對人員要求不高。劣勢在于樣品基質復雜、粗肽組份繁雜，對液相的穩定性要求非常高。峰組ABCD的保留時間穩定性在1%以內、峰面積重現性在2%以內。每組六針進樣壓力曲線都非常平穩波動僅在0.4 bar，該方法穩定性非常好。
3、創造性的將粗肽分析與中藥指紋圖譜相似度評價軟件相結合，可以從整體分析、在宏觀上了解粗肽批次間的差異；憑借Vanquish液相的穩定性，在變色龍軟件里平行比較兩批次樣品譜圖的細節差異。進而從宏觀和微觀兩方面入手，在調控酶解、過膜超濾、GPC分離等工藝環節中發揮指導作用。解決粗肽可視化直觀化的質控問題。
4、做相似度評價時，建議選取成熟穩定粗肽樣品中主要成分色譜峰或峰組作為評價標的。積分時通過加大平滑將色譜峰以峰組的形式積分，即簡化譜圖，又可提升譜圖間可比性。通常相似度0.9以上認為批次間是穩定一致的。解決粗肽質控評價標準的建立問題。
5、從向食品中添加大豆肽，以提升食品（代乳制品、醬油、面食等）營養和品質角度來說，本法做來料質控基本可行。從向食品中添加活性肽，打造功能性保健食品角度來說，還需進一步對來料做超濾膜分離，得到5000Da以下的肽，本法為MS友好流動相可以直接結合高分辨質譜找到有價值的活性肽。從科研角度來說，本法基礎上擴展CAD電霧式檢測器，可以檢測無紫外吸收和弱紫外吸收的物質，如氨基酸、GABA（伽馬氨基丁酸）、單糖多糖等。
6、客戶要求用Accucore 1.5 μm的色譜柱開發該方法，以期面對極其復雜樣品時，能得到較好分離度，考慮到樣品和基質實際情況，推薦客戶試用Hypersil GOLD Peptide 1.9um，175?色譜柱兩根串聯使用提高復雜樣品分離能力，賽默飛還有其他適合分析多肽的色譜柱，如Accucore 150 C4，Acclaim 300 C18，BioBasic 300?等。
7、該方法操作簡單僅需過濾樣品即可，是降本又增效的液相色譜分析方案，將會對食品工業中添加粗肽、大豆肽的企業提高品控水平。
8、本文為探索性質的實驗。為解決粗肽、大豆肽生產過程中部分質控問題，提出跨界解決問題的思路，若能結合GPC做分子量分布研究，將其整合為一套完整方案，則產品質控會更加全面嚴謹，終將有利于生成企業、消費者和監管部門。
合作伙伴
李丹課題組：李丹，男，生于1972年10月；江南大學食品科學博士、韓國國立首爾大學 (Seoul National University) 食品科學與生物技術系博士后、美國佛羅里達大學 (University of Florida) 微生物與細胞科學系訪問學者；教育部新世紀優秀人才；吉林省二級教授，吉林省有突出貢獻的中青年專業技術人才，吉林省拔尖創新人才二層次。現任長春大學“大豆生物加工技術吉林省發改委工程實驗室"主任、“農產品加工吉林省教育廳重點實驗室"主任。主要從事食品科學與農產品加工技術領域的教學與科研工作。主持完成國家自然科學基金“面上項目"2項，主持完成科技部“國際科技合作項目"1項，主持完成“教育部新世紀優秀人才支持計劃"和“教育部留學回國人員科研基金"項目2項，主持完成省市廳級科技計劃項目11項；在本學科國際著名SCI期刊，發表英文論文50余篇，其中在中科院學術期刊分區一區期刊發表論文18篇；獲得授權發明6件，獲得英國Elsevier最多引用論文獎、吉林省科技廳吉林省科技獎自然科學獎二等獎等省部級科研成果獎勵9項。
參考文獻：
【1】大豆多肽的研究進展 高蕾蕾，李迎秋2018 年第 2 期 江蘇調味副食品 總第 153 期 ＊? DOI: 10. 16782 /j． cnki． 32-1235 /ts． 2018. 02. 002
【2】大豆蛋白酶水解產物對面粉糊化特性的影響崔會娟，王璐，郭興鳳 *河南工業大學學報（自然科學版） Journal of Henan University of Technology（Natural Science Edition） 第 36 卷第 1 期 2015 年 2 月
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