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1. 前言

復方duo粘菌素B軟膏為硫酸duo粘菌素B、硫酸xin霉素、gan菌肽和鹽酸li多卡因組成的復方制劑，用于預防皮膚割傷、擦傷、燒燙傷、手術傷口等皮膚創面的細菌感染及暫時緩解疼痛等不適癥狀。硫酸duo粘菌素B為多肽類抗生素，通過干擾細菌膜通透性與核糖體功能而導致細菌死亡，對銅綠假單胞菌、大腸桿菌、嗜血桿菌等有良好的抗菌作用。硫酸xin霉素為氨基糖苷類抗生素，可阻礙細菌核糖體30S亞基相聯結的蛋白質合成，引起其遺傳密碼錯讀而導致細菌死亡，抗菌譜較廣。gan菌肽為多肽類抗生素，通過抑制細菌細胞壁粘肽的合成而導致細菌死亡，主要對革蘭氏陽性菌尤其對常見的jinhuangse葡萄球菌和各種鏈球菌抗菌活性強，對革蘭氏陰性球菌和某些放線菌、螺旋體、阿米巴原蟲也有一定的抑制作用。鹽酸li多卡因為酰胺類局部麻醉藥，其作用機制為阻止神經脈沖的發生、傳導與傳播。

duo粘菌素B和gan菌肽作為多肽類抗生素，通常采用液相色譜紫外檢測器法或微生物法測定。而硫酸xin霉素的紫外吸收較弱，一般采用通用型檢測器進行分析。鹽酸li多卡因則采用另一種液相色譜紫外方法進行檢測。因此對于該復方制劑，可能需要2~3種液相色譜檢測法來分析其主要成分，其質控流程較為繁瑣和耗時。也有研究采用HPLC-ELSD法來分析上述4種主要物質，但該方法易受到復雜基質的影響，靈敏度和重復性往往不能滿足檢測需求。

本應用嘗試采用HPLC-CAD法對這4種主要成分同時進行檢測分析，考慮到這4種主要成分有的缺乏紫外生色團，有的紫外吸收波長較低，易受干擾。但這4種主要成分通常不揮發，電霧式檢測器（CAD）非常適合作為主要的檢測手段。與蒸發光散射檢測器（ELSD）或示差折光檢測器（RI）相比，CAD可兼容梯度洗脫，具有更高的靈敏度，可降低復雜基質的干擾。

duo粘菌素B結構式：

硫酸xin霉素結構式：

gan菌肽結構式：

鹽酸li多卡因結構式：

2. 實驗方法

2.1

儀器

Thermo Fisher Vanquish Core高效液相色譜儀，泵：Quaternary Pump C，自動進樣器：Split Sampler CT，柱溫箱：Column Compartment C，CAD檢測器：Vanquish CAD H。色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3

2.2

試劑

乙腈、甲酸、三氯yi酸（色譜級，Fisher），去離子水（18.2 M?@25°C，Millipore純水機）。

2.3

儀器

硫酸duo粘菌素B、硫酸xin霉素、gan菌肽和鹽酸li多卡因

2.4

樣品

市售復方duo粘菌素B軟膏

2.5

色譜條件

色譜柱：Phenyl 4.6mm×250mm，5 µm
柱溫：40°C
檢測器參數：蒸發溫度50℃，采集頻率5Hz，Filter 3.6s，PFV 1.0
進樣量：5µL
流動相A：40mM三氯yi酸，B：甲醇， C：乙腈
梯度洗脫：參見表1
流速：1.0 mL/min

表1：梯度洗脫程序

3. 實驗結果

3.1 專屬性和線性范圍

分別取硫酸duo粘菌素B、硫酸xin霉素、gan菌肽和鹽酸li多卡因適量，用水溶解并稀釋得到一系列不同濃度的混標溶液，考察專屬性和線性情況。各單標溶液及空白溶劑疊加色譜圖如圖1所示，結果表明該方法條件下各物質分離效果、峰形及峰響應均良好，空白溶液無干擾。

圖1：4種單標及空白（黑色）疊加色譜圖

混標溶液的典型色譜圖如圖2所示，取4~40ppm濃度范圍的混標溶液分別進樣，繪制標準曲線。

圖2：混標溶液典型色譜圖

圖3：各物質的標準曲線

結果顯示， 各物質在其濃度范圍內線性良好，相關系數均≥ 0.997

表2：方法線性結果

3.2 靈敏度

將混標溶液不斷稀釋并進行檢測，通過信噪比（S/N）值來考察CAD檢測器對硫酸duo粘菌素B、硫酸xin霉素、gan菌肽和鹽酸li多卡因的靈敏度。如圖4所示，當混標濃度為8ppm時，各物質的S/N接近定量限要求；當混標濃度為4ppm時，各物質的S/N接近檢測限要求,結果表明HPLC-CAD方法靈敏度較高。

圖4：各物質的檢測限（LOQ）和定量限（LOD）

3.3 重復性

取濃度為20ppm的混標溶液連續進樣6針后計算各物質峰面積的%RSD，來考察CAD檢測器的重復性，結果見表3、圖5。

表3：各物質重復性結果

圖5：重復性結果色譜圖

3.4 樣品分析

取市售復方duo粘菌素B軟膏樣品適量，加水混勻，振蕩30分鐘后離心3分鐘，取上清液過微孔濾膜后直接進樣分析，實驗結果表明樣品中各物質峰形，靈敏度及分離度等均符合分析要求（圖6）。

圖6：市售樣品色譜圖

4. 結論

本應用建立一種HPLC-CAD法，可對復方duo粘菌素B軟膏中的硫酸duo粘菌素B、硫酸xin霉素、gan菌肽和鹽酸li多卡因這4種主要成分同時進行檢測分析。該方法靈敏度較高，檢測限可低至4µg/mL；重復性好，連續6針峰面積%RSD均＜2.5%；基質干擾小，市售產品中的各物質峰基本不受基質影響。本應用方法方便、快捷，可有效提高檢測效率，縮短產品質控流程。