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在上期內容里簡要介紹了賽默飛Acclaim系列混合模式色譜柱的理化性質、保留機制及典型應用，那么這一期我們將進一步探討混合模式方法開發過程中的色譜柱選擇及色譜條件優化細節。

混合模式方法開發的重點和難點，主要集中在色譜柱選擇、流動相選擇、檢測器選擇以及色譜條件優化，接下來我們針對每一個細節進行探討，并總結一些經驗及注意事項，為藥物色譜分析提供借鑒和參考。

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色譜柱的選擇

根據化合物的理化性質，準確識別分子結構的特征官能團，如苯環、烴鏈等的疏水官能團，羧酸、磺酸等酸性官能團，胺類、含氮雜環等堿性官能團，多羥基官能團（糖類），強極性化合物及陰陽離子。針對不同類型目標物，Acclaim系列混合模式色譜柱適用范圍，如表1所示：

具有反相保留的酸性化合物推薦色譜柱：Acclaim Mixed-Mode WAX-1，Acclaim Trinity P1；

具有反相保留的堿性化合物推薦色譜柱：Acclaim Mixed-Mode WCX-1，Acclaim Trinity P1；

具有多羥基結構的中性化合物推薦色譜柱：Acclaim Mixed-Mode HILIC-1，Acclaim Trinity P2;

強極性化合物推薦色譜柱：Acclaim Trinity P1，Acclaim Trinity P2，Acclaim Trinity Q1；

活性藥物成分與對離子分析推薦色譜柱：Acclaim Trinity P1，Acclaim Trinity P2。

表1針對不同類型目標物，Acclaim系列混合模式色譜柱適用范圍匯總

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流動相的選擇

有機相：除Acclaim Mixed-Mode HILIC-1外，Acclaim系列混合模式色譜柱均涉及離子交換作用，基于洗脫強度及離子交換可控的考量，通常建議有機相使用非質子溶劑——乙腈。對于 Acclaim Mixed-Mode WCX-1，Acclaim Trinity P2 和 Acclaim Trinity Q1具有弱陽離子交換（WCX）功能的色譜柱禁止使用醇類（甲醇、乙醇、異丙醇等）作為樣品溶劑或流動相，因為醇類在一定條件下會與羧酸官能團發生酯化反應，導致保留時間漂移。Acclaim Mixed-Mode HILIC-1在分析聚乙二醇PEGs時，可使用甲醇作為有機相；Acclaim Surfactant Plus在分析吐溫-80時，可使用異丙醇作為有機相。

水相（緩沖鹽）： Acclaim系列混合模式色譜柱在活化、分析或保存的過程中，為避免因電荷無法中和而導致離子交換官能團出現坍塌，因此水相必須含緩沖鹽，通常建議使用甲酸銨、乙酸銨或磷酸緩沖鹽，緩沖鹽種類、濃度及pH調節，應根據化合物理化性質、檢測器類型來選定。對于 Acclaim Mixed-Mode WAX-1，和 Acclaim Surfactant Plus 具有弱陰離子交換（WAX）功能的色譜柱在乙腈-10 mM 乙酸銨（pH=5.0）充分過渡后，推薦用 100% 乙腈作為長期儲存溶劑。Acclaim Mixed-Mode HILIC-1可使用純水作為水相。

緩沖鹽pH：Acclaim系列混合模式色譜柱耐受pH范圍通常為2.5-7.5，推薦使用的pH范圍為3.0-6.0，賽默飛實驗室通常會在pH=4.0/5.0/6.0三個值進行緩沖鹽pH篩選。混合模式下緩沖鹽pH較為溫和，pH=4.0偏酸性，在Acclaim Mixed-Mode WCX-1分析堿性化合物時，既可以讓目標物充分電離，同時不會抑制固定相的羧基官能團；pH=6.0偏堿性，在Acclaim Mixed-Mode WAX-1分析酸性化合物時，既可以讓目標物充分電離，同時不會抑制固定相上的叔胺官能團。當分析物質中酸性/堿性化合物同時存在時，可嘗試pH=5.0的緩沖鹽以兼顧二者的保留。

在混合模式方法開發中，常見的洗脫程序有等度洗脫程序、有機相梯度洗脫程序和緩沖鹽梯度+有機相梯度洗脫程序，如圖1所示。在洗脫過程中調節有機相-緩沖鹽比例時，應盡可能避免出現鹽析。

圖1在混合模式方法開發中，常見的洗脫程序

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檢測器兼容性

與反相C18色譜柱一樣，無論是單一鍵合的Bi-modal，還是納米聚合物硅膠雜化的Tri-modal，Acclaim系列混合模式色譜柱鍵合相穩定，柱流失較低，與常見的濃度型檢測器（DAD/MWD/VWD/FLD）和質量型檢測器（ELSD/CAD/MSD）具有高度的兼容性。化合物有較強紫外吸收時，可選擇紫外檢測器；化合物有熒光響應時，可選擇熒光檢測器；化合物在紫外端吸收較弱或無特征吸收時，可選擇電噴霧檢測器。在使用電噴霧檢測器時，應選擇揮發性緩沖鹽，如甲酸銨、乙酸銨；在使用紫外檢測器時，目標物檢測波長接近紫外端時，應選擇截止波長較低的磷酸緩沖鹽。

Acclaim系列混合模式色譜柱與常見檢測器的兼容性，如表2 所示。

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選擇性 α 的優化

在反相模式下，通過調節選擇性 α 來優化分離和保留是最為有效的，而選擇性 α 主要受流動相和固定相的影響，因此，調節有機相比例和種類、調節流動相 pH（水相）和改變固定相類型是優化反相分離和保留最常見的三種方法。

在混合模式下，有機相優先推薦使用乙腈，并且緩沖鹽濃度對離子交換影響較大，因此，優化混合模式分離和保留的方法有調節離子強度、調節流動相 pH（水相）、調節有機相比例和改變固定相類型，其中調節離子強度和調節有機相比例較為常用。

如圖2所示，在Acclaim Mixed-Mode WAX-1色譜柱上，通過調節選擇性 α 來優化丁基苯和對羥基苯甲酸的分離和保留；如圖3所示，在相同色譜條件下，苯甲酸、萘和芐胺分別在Acclaim Mixed-Mode WCX-1和Acclaim Mixed-Mode WAX-1上表現出不同的選擇性。

圖2在Acclaim Mixed-Mode WAX-1色譜柱上，通過調節選擇性 α 來優化丁基苯和對羥基苯甲酸的分離和保留（點擊查看大圖）

圖3在相同色譜條件下，苯甲酸、萘和芐胺分別在WCX-1和WAX-1上表現出不同的選擇性

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如圖4和圖5所示，在Acclaim Trinity P1色譜柱上，通過調節有機相比例和緩沖鹽濃度來優化Na⁺、K⁺、Cl^-和Br^-離子的分離和保留。

圖4在Acclaim Trinity P1色譜柱上，通過調節有機相比例來優化Na⁺、K⁺、Cl^-和Br^-離子的分離和保留（點擊查看大圖）

圖5在Acclaim Trinity P1色譜柱上，通過調節緩沖鹽濃度來優化Na⁺、K⁺、Cl^-和Br^-離子的分離和保留（點擊查看大圖）

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方法開發案例分享

羧jia司坦分子結構含兩個羧基和一個氨基，pKa=2.06±0.10(Predicted)，屬于酸性化合物，因此選擇Acclaim Mixed-Mode WAX-1色譜柱。羧jia司坦在近紫外端無特征吸收波長，考慮到其他雜質的響應，檢測波長選擇215nm，因此緩沖鹽須選擇截止波長較低的磷酸緩沖鹽。最終流動相選定為乙腈-25mM磷酸氫二銨（磷酸調節pH至6.0），并配合梯度洗脫，羧jia司坦與相關雜質可有效分離，峰形良好，柱效優異，分離譜圖及數據如圖6 所示。

圖6 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 應用于羧jia司坦有關物質的測定（點擊查看大圖）

托吡ka胺分子結構含苯環、吡啶環、酰胺和羥基，經查詢化合物 pKa=5.3 (Uncertain)，由于吡啶環是一個典型的堿性結構，并且有關物質中的工藝雜質多為堿性化合物，因此選擇Acclaim Mixed-Mode WCX-1色譜柱。流動相緩沖鹽選擇50mM磷酸氫二銨（磷酸調節pH至4.0），并采用乙腈-水-緩沖鹽等度洗脫，托吡ka胺保留時間在8min左右。對照溶液濃度2.0mg/mL，進樣量50μL，主峰托吡ka胺并未出現嚴重過載，表明Acclaim Mixed-Mode WCX-1具有較高的載樣量，相關雜質均能有效分離，且靈敏度較好，分離譜圖及數據如圖7所示。

圖7 Acclaim Mixed-Mode WCX-1 應用于托吡ka胺有關物質的測定（點擊查看大圖）

在陰陽離子Na⁺、K⁺、Cl^-、Br^-、I^-和SO₄^2-的分析中，實驗室采用Acclaim Trinity P1色譜柱配合CAD檢測器，流動相緩沖鹽選擇揮發性的乙酸銨，由于二價硫酸根洗脫需要高濃度的緩沖鹽，參考早期實驗方案的譜圖及數據，乙酸銨濃度選定為200mM，用乙酸調節pH至5.0。流動相選擇乙腈-水-緩沖鹽梯度洗脫，Na⁺ 和K⁺，Cl^- 和Br^-，兩組離子分離度良好，分離度分別為2.17和1.71，SO₄^2-在洗脫程序后期90%高濃度緩沖鹽的洗脫下，峰寬較窄，峰形優異，不對稱因子為1.28，分離譜圖及數據如圖8所示。

圖8 Acclaim Trinity P1 應用于 Na⁺、K⁺、Cl^-、Br^-、I^-、SO₄^2- 的含量測定（點擊查看大圖）

如需更為詳盡的Acclaim系列混合模式色譜柱方法開發資料，可從賽默飛下載色譜柱產品說明及使用指南：

Product Specifications 產品說明

PS22091-EN ：Acclaim Mixed-Mode WAX-1 column: Total Control of Selectivity

PS22092-EN ：Acclaim Mixed-Mode WCX-1 column: For Separating Basic Molecules

PS22090-EN ：Acclaim Mixed-Mode HILIC-1 column: A powerful tool for separating polar molecules

PS22083-EN ：Acclaim Trinity P1 column: Superior pharmaceutical and counterion separations

PS20861-EN ：Acclaim Trinity P2 column: Ideal solution for pharmaceutical counterion analysis

PS20567-EN ：Acclaim Trinity Q1 column: For trace analysis of diquat and paraquat

PS20477-EN ：Acclaim Surfactant Plus column: Performance, versatility, throughput

Product Manual 使用指南

Acclaim Mixed-Mode WAX-1 Columns

Acclaim Mixed-Mode WCX-1 Columns

Acclaim Trinity P1 Product Manual

Acclaim Trinity P2 Product Manual

Acclaim Trinity Q1 Product Manual

Acclaim Surfactant Plus Product Manual

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● 賽默飛混合模式色譜柱方法開發指南 (Ⅰ)

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