細胞簡介：

兔真皮微血管內皮細胞分離自真皮組織；真皮，位于表皮深層，向下與皮下組織相連，真皮結締組織的膠原纖維和彈性纖維互相交織在一起，埋于基質內。其內分布著各種結締組織細胞和大量的膠原纖維彈性纖維，使皮膚既有彈性，又有韌性。其由兩層組成——乳頭層與網(wǎng)狀層。真皮的結構組成是膠原蛋白、彈性纖維以及基質。微血管內皮細胞（MEC）在炎癥反應、腫瘤生長、創(chuàng)面愈合過程中起著非常重要的作用。在創(chuàng)面愈合研究領域，由于表皮細胞、真皮成纖維細胞體外培養(yǎng)技術的成熟，人們對這兩種細胞早已進行了大量深入的研究。與之相比，對參與創(chuàng)面愈合過程的另一種主要細胞——真皮微血管內皮細胞，則因其體外分離培養(yǎng)技術的困難而使相關的研究受限。
方法簡介：

實驗室分離的兔真皮微血管內皮細胞采用膠原酶-中性蛋白MEI混合消化法結合密度梯度離心法、最后通過內皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質量檢測：

實驗室分離的兔真皮微血管內皮細胞經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

1) 將5-10d的乳鼠浸泡入75%乙醇中，移入生物安全柜，

2) 從胸部解剖乳鼠，取出雙肺置于預冷的PBS中，盡可能的除去結締組織等，

3) 取肺邊緣部分，剪碎，將組織塊移入T25培養(yǎng)瓶中，倒置于細胞培養(yǎng)箱中，

4) 2h后，培養(yǎng)瓶中注入2 mL內皮培養(yǎng)基，小心將培養(yǎng)瓶正置于培養(yǎng)箱，確保組織塊不會飄起來，

5) 每3d換液2mL，待細胞從組織塊中爬出來后，隔2d換液，待細胞融合達到60-70%左右時，去除組織塊，將肺微血管內皮細胞重新鋪瓶。

1、您收到細胞后，請按照以下方法進行操作：

取出T-25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置4-6小時或過夜，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)，然后換用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進行傳代。

2、細胞傳代：

1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）棄上清，沉淀細胞用12ml培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進行分瓶傳代，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）待細胞貼壁后，觀察培養(yǎng)結果，之后進行換液培養(yǎng)或傳代。

3、細胞凍存：

1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后輕輕吹打細胞使之脫落，再加入培養(yǎng)液終止消化，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）用適當量的凍存液（基礎培養(yǎng)基：FBS：DMSO=7:2:1）重懸細胞，并放置于凍存管中；

4）先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉入液氮中進行長期保存。

4、細胞復蘇：

1）從液氮中取出細胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）， 快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2）將凍存管中的細胞移至15ml無菌離心管中，滴加入培養(yǎng)液5ml混勻細胞，然后將細胞懸液轉移至適當面積大小的培養(yǎng)皿中；

3）放置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。