（貨號：WLE8202KIT）
產(chǎn)品名稱
DNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型）、熒光型DNA恒溫快速擴增試劑盒
原理概述：
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點形成D-loop區(qū)域，并開始對DNA雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。本試劑盒在39 oC下，依賴核酸外切酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計的特異的分子探針，使用熒光監(jiān)測設(shè)備能實現(xiàn)對目標(biāo)片段擴增過程的實時監(jiān)控。
產(chǎn)品特點：
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應(yīng)時間短（僅需20 mins）等優(yōu)點，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡便，易于保存。
可適用于各種品牌的熒光定量PCR儀、恒溫?zé)晒鈹U增儀器等熒光檢測設(shè)備。
引物設(shè)計：
建議使用長度在30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；引物設(shè)計避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。
熒光探針設(shè)計：
探針序列不與特異性引物識別位點重疊，長度為46-52 nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有四個修飾位點：距離5’端的≥35 nt的中部位置標(biāo)記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點；THF位點的上游標(biāo)記一個熒光基團，下游標(biāo)記一個粹滅基團，兩個基團的間距為2-4 nt；THF距離3’末端≥15 nt，并且3’末端標(biāo)記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer。
試劑盒組成：
| 組成 | 含量 |
| A buffer | 1.6 mL×1管 |
| B buffer | 150 μL×1管 |
| 正對照模板 | 30 μL×1管 |
| 正對照引物探針Mix | 70 μL×1管 |
| 試劑 | 48份 |
| 使用說明書 | 1份 |
試劑盒儲存：
運輸條件：低溫運輸；
儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復(fù)凍融；
產(chǎn)品有效期：12個月。
操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。
1) 每個干粉反應(yīng)管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需融化混勻，否則會對實驗效果產(chǎn)生影響）；
2) 每個反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；
3) 向反應(yīng)管中依次加入11.5 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為13.5 μL）；
4) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（請務(wù)必上下顛倒甩動反應(yīng)管8-10次進行混勻；對于多個反應(yīng)，建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)上下顛倒后混勻）；
5) 混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入熒光檢測設(shè)備中。熒光檢測程序設(shè)置為：恒溫39 oC；每30 s采集一次FAM通道（信號采集通道的選擇與熒光探針設(shè)計一致）熒光值；反應(yīng)時間20 mins。
注：如使用ABI系列PCR儀，請務(wù)必于passive reference和quencher處均選擇“none”。
體系配制
| 組分 | 體積（μL） |
| A buffer | 29.4 |
| 上游引物(10 μM)* | 2 |
| 下游引物(10 μM)* | 2 |
| 探針(10 μM)* | 0.6 |
| ddH2O 和DNA模板 | 13.5 |
| B buffer | 2.5 |
| 總體積 | 50 |
*正對照反應(yīng)單元體系配制：正對照模板加入2μL，加入4.6 μL正對照引物探針Mix（已包含探針和上/下游引物），其他組分參照體系配制。
注意事項：
1． 由于試劑盒靈敏度非常高，在進行反應(yīng)時請注意避免核酸污染，并設(shè)置空白對照；
2． 使用時請取出實驗所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，剩余部分請置于存儲條件下。
