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熒光型DNA恒溫快速擴增試劑盒

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  • 型號
  • 品牌
  • 所在地北京市
  • 更新時間2023-08-13
  • 廠商性質(zhì)其他
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  • 實名認證已認證
  • 產(chǎn)品數(shù)量92
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熒光型DNA恒溫快速擴增試劑盒 產(chǎn)品詳情

(貨號:WLE8202KIT

產(chǎn)品名稱

DNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)、熒光型DNA恒溫快速擴增試劑盒

原理概述:

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術(shù):在常溫恒溫下,重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA,在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下,侵入雙鏈DNA模板;在侵入位點形成D-loop區(qū)域,并開始對DNA雙鏈進行掃描;待找到與引物互補的目的區(qū)域后,復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時,聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端,開始鏈的延伸。本試劑盒在39 oC下,依賴核酸外切酶的作用,加入根據(jù)模版設(shè)計的特異的分子探針,使用熒光監(jiān)測設(shè)備能實現(xiàn)對目標(biāo)片段擴增過程的實時監(jiān)控。

產(chǎn)品特點:

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應(yīng)時間短(僅需20 mins)等優(yōu)點,反應(yīng)組分為干粉狀態(tài),操作簡便,易于保存。

可適用于各種品牌的熒光定量PCR儀、恒溫?zé)晒鈹U增儀器等熒光檢測設(shè)備。

引物設(shè)計:

建議使用長度在30-35 bp的引物,引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度;引物設(shè)計避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴增;擴增子長度建議在150-300 bp,通常不超過500 bp。

熒光探針設(shè)計:

探針序列不與特異性引物識別位點重疊,長度為46-52 nt,序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有四個修飾位點:距離5’端的≥35 nt的中部位置標(biāo)記一個dSpacer(四氫呋喃,THF),作為核酸外切酶的識別位點;THF位點的上游標(biāo)記一個熒光基團,下游標(biāo)記一個粹滅基團,兩個基團的間距為2-4 nt;THF距離3’末端≥15 nt,并且3’末端標(biāo)記一個修飾基團,例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer。

試劑盒組成:

組成 含量
A buffer 1.6 mL×1管
B buffer 150 μL×1管
正對照模板 30 μL×1管
正對照引物探針Mix 70 μL×1管
試劑 48份
使用說明書 1份

試劑盒儲存:

運輸條件:低溫運輸;

儲存條件:儲存溫度 ≤ -20 oC,避光保存,避免重壓、反復(fù)凍融;

產(chǎn)品有效期:12個月。

 

操作步驟:提前30分鐘將試劑盒所需組分取出,室溫融化,震蕩混勻

1) 每個干粉反應(yīng)管加入29.4 μL A buffer(注意:A buffer需融化混勻,否則會對實驗效果產(chǎn)生影響);

2) 每個反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針(引物和探針濃度為10 μM,對于多個反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中);

3) 向反應(yīng)管中依次加入11.5 μL ddH2O和2 μL核酸模板(可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積,并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH2O體積,至模板與ddH2O總體積為13.5 μL);

4) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合(請務(wù)必上下顛倒甩動反應(yīng)管8-10次進行混勻;對于多個反應(yīng),建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)上下顛倒后混勻);

5) 混勻后,將反應(yīng)液甩(或快速離心)至管子底部,然后立即將反應(yīng)管放入熒光檢測設(shè)備中。熒光檢測程序設(shè)置為:恒溫39 oC;每30 s采集一次FAM通道(信號采集通道的選擇與熒光探針設(shè)計一致)熒光值;反應(yīng)時間20 mins。

注:如使用ABI系列PCR儀,請務(wù)必于passive referencequencher處均選擇“none”

體系配制

組分 體積(μL)
A buffer 29.4
上游引物(10 μM)* 2
下游引物(10 μM)* 2
探針(10 μM)* 0.6
ddH2O 和DNA模板 13.5
B buffer 2.5
總體積 50


*正對照反應(yīng)單元體系配制:正對照模板加入2μL,加入4.6 μL正對照引物探針Mix(已包含探針和上/下游引物),其他組分參照體系配制。

注意事項:

1. 由于試劑盒靈敏度非常高,在進行反應(yīng)時請注意避免核酸污染,并設(shè)置空白對照;

2. 使用時請取出實驗所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量,剩余部分請置于存儲條件下。

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