支原體污染會(huì)影響ATCC細(xì)胞的形態(tài)、功能、代謝、細(xì)胞膜、生長(zhǎng)速率、誘導(dǎo)染色體畸變、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等各種細(xì)胞特性。受支原體污染的細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基的pH值不會(huì)發(fā)生改變, 也不會(huì)渾濁,因此, 很難直接觀察出細(xì)胞是否受到污染。常用的支原體檢測(cè)方法有培養(yǎng)法、DNA熒光染色法、酶聯(lián)免疫吸附法和PCR法等。

1. 培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是Z傳統(tǒng)的檢測(cè)方法, 該方法能直觀地顯示是否存在支原體污染。將細(xì)胞培養(yǎng)物置于PPLO肉 湯 培 養(yǎng) 基(pleuropneumo-nia-like organismsbroth base)中, 37 °C培養(yǎng)3天后離心, 將沉淀物轉(zhuǎn)移至PPLO瓊脂培養(yǎng)基相同條件下培養(yǎng)4~6周, 觀察是否有“煎雞蛋”樣菌落出現(xiàn), 若有即為支原體污染。

這種方法簡(jiǎn)單易行, 但耗時(shí)比較長(zhǎng), 且存在不少缺陷。支原體由于遺傳缺陷, 導(dǎo)致某些代謝途徑缺失, 其生長(zhǎng)很大程度依賴于培養(yǎng)基的成分。在
配制培養(yǎng)基時(shí), 任何成分質(zhì)量或批次的不同都會(huì)影響支原體的生長(zhǎng), 從而影響檢測(cè)的靈敏度。不同的生長(zhǎng)條件(如好氧、厭氧、微氧等)也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果, 易導(dǎo)致假陽性。此外, 還有許多支原體無法培養(yǎng), 因此, 使用培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果并不全面。

2. DNA熒光染色法

DNA熒光染色法是基于使用熒光染料DAPI或Hoechst 33258的細(xì)胞化學(xué)染色法。熒光染料能選擇性的結(jié)合ATCC細(xì)胞和支原體DNA的小溝, 因此, 在準(zhǔn)備過程中, 任何存在的DNA均會(huì)被染色且DNADAPI復(fù)合物吸收波長(zhǎng)為340~488nm。將待測(cè)細(xì)胞單層培養(yǎng)至70%~90%匯合度時(shí),  以5×104/mL~1×105/mL濃度轉(zhuǎn)接至蓋玻片上培養(yǎng)12~24小時(shí), 用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌, 并在37 °C下用DAPI-甲醇溶液染色15分鐘, 無菌水洗滌
并烘干后置于檸檬酸緩沖液(pH5.5)?甘油(2?1)條件中, 用指甲油密封。處理后的玻片置于熒光顯微鏡下觀察, 被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后, 細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光點(diǎn)。

3. ELISA法

酶促反應(yīng)作為生物化學(xué)檢測(cè)手段可應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞中支原體的檢測(cè), 如通過測(cè)乙酸激酶、氨基甲酸激酶等各類酶的活性, 能快速、靈敏地對(duì)
細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行篩選檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbnentassay, ELISA)試劑可通過商業(yè)渠道購(gòu)買, 其中包括針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見支原體/膽甾原體抗原的多克隆抗體。用于檢測(cè)的抗體與生物素共軛結(jié)合后, 鏈霉親和堿性磷酸酶水解4-硝基苯基磷酸生成黃色的硝基苯酚產(chǎn)物, 在405 nm波長(zhǎng)下通過酶標(biāo)儀量化。ELISA檢測(cè)支原體污染有較好的特異性和敏感性, Z顯著的優(yōu)點(diǎn)是能一次檢測(cè)大量樣品。

4. 基于DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增檢測(cè)

PCR技術(shù)是根據(jù)DNA高溫變性、低溫退火、適溫延伸的原理進(jìn)行的擴(kuò)增技術(shù)。自Uemori等公布了12種支原體16S-23S rRNA區(qū)域的序列后, 應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行支原體檢測(cè)的研究迅速發(fā)展。16S、16S-23S、23S rRNA是支原體基因組內(nèi)的保守區(qū)域, 根據(jù)這些區(qū)域的序列設(shè)計(jì)特異性引物, 使用PCR的方法擴(kuò)增后, 利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè), 通過比對(duì)分析擴(kuò)增產(chǎn)物的大小, 可進(jìn)行支原體感染的初步分析鑒定。PCR檢測(cè)法與傳統(tǒng)培養(yǎng)或熒光染色技術(shù)相比,
ATCC細(xì)胞具有快速、穩(wěn)定、易重復(fù)及靈敏度高等特點(diǎn)。但易受其他污染物如細(xì)菌、真菌影響導(dǎo)致假陽性結(jié)果, 且仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段, 尚無標(biāo)準(zhǔn)、準(zhǔn)確的一套檢測(cè)方案。