基本概念

   原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。 
    用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態, 如是否有點突變、擴增重排等。

實驗步驟

一、基因組DNA的制備

二、基因組DNA的限制酶切

根據實驗目的決定酶切DNA的量。一般Southern雜交每一個電泳通道需要10-30μg的DNA。購買的限制性內切酶都附有相對應的10倍濃度緩沖液，并可從該公司的產品目錄上查到消化溫度。為保證消化*，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA濃度不宜太高，以0.5μg /μl 為好。具體操作如下：在1.5ml離心管中依次加入

DNA（1μg /μl）                    20 μg
10×酶切buffer                      4.0 μl
限制性內切酶（10U/μl）        5.0 μl
加ddH2O             至          500 μl

在zui適溫度下消化1-3hour。消化結束時可取5μl電泳檢測消化效果。若消化效果不好，可以延長消化時間，但超過6hour已沒有必要。或者放大反應體積，或者補充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質，或酶的活力下降。

消化后的DNA加入1/10 體積的0.5M EDTA，以終止消化。然后用等體積酚抽提、等體積氯仿抽提，2.5倍體積乙醇沉淀，少量TE溶解。

如果需要兩種酶消化DNA，而兩種酶的反應條件可以一致，則兩種酶可同時進行消化；如果反應條件不一致，則先用需要低離子強度的酶消化，然后補加鹽類等物質調高反應體系的離子強度，再加第二種酶進行消化。

三、基因組DNA消化產物的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段zui常用的方法，制備簡單，分離范圍廣（200bp-50kb），實驗成本低。下表列舉了不同濃度瓊脂糖凝膠能分離的DNA片段范圍。

表：不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍

1. 制備0.8%凝膠：一般用于Southern雜交的電泳膠取0.8%。

2.  電泳：電泳樣品中加入6×Loading 緩沖液，混勻后上樣，留一或兩泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA從負極泳向正極。電泳至溴酚藍指示劑接近凝膠另一端時，停止電泳。取出凝膠，紫外燈下觀察電泳效果。在膠的一邊放置一把刻度尺，拍攝照片。正常電泳圖譜呈現一連續的涂抹帶，照片攝入刻度尺是為了以后判斷信號帶的位置，以確定被雜交的DNA長度。

四、轉膜

轉膜就是將瓊脂糖凝膠中的DNA 轉移到硝酸纖維膜（NC膜）或尼龍膜上，形成固相DNA。轉移的目的是使固相DNA與液相的探針進行雜交。轉膜時可根據不同需要選擇不同的固相支持物用于雜交。。常用的轉移方法有鹽橋法、真空法和電轉移法。

五、探針標記

進行Southern 雜交的探針一般用放射性物質標記.而探針的標記方法有隨機引物法、切口平移法和末端標記法，有一些試劑盒可供選擇，操作也很簡單。

例：

1. 取25-50ng模板DNA于0.5ml離心管中，100℃變性5min，立即置冰浴。

2. 在另一個0.5ml離心管中加入：

Labeling 5×buffer   （含有隨機引物）                              10μl
dNTPmix  (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)                               2μl
BSA（小牛血清白蛋白）                                          2μl
[a-32P]dATP                                                          3μl
Klenow酶                                                             5U

3. 將變性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl，混勻。室溫或37℃ 1hr。

4. 加50μl 終止緩沖液終止反應。

標記后的探針可以直接使用或過柱純化后使用。

六、雜交

Southern 雜交一般采取的是液-固雜交方式，即探針為液相，被雜交DNA為固相。雜交發生于一定條件的溶液（雜交液）中并需要一定的溫度，可以用雜交瓶或雜交袋并使液體不斷的在膜上流動。雜交液可以自制或從公司購買，不同的雜交液配方相差較大，雜交溫度也不同。下面給出的為一雜交液配方：

PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺。該雜交液的雜交溫度為42℃。

1. 預雜交

NC膜浸入2×SSC中5min，在雜交瓶中加入雜交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），將膜的背面貼緊雜交瓶壁，正面朝向雜交液。放入42℃雜交爐中，使雜交體系升到42℃。取經超聲粉碎的鮭魚精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加熱變性5min，迅速加到雜交瓶中，使其濃度達到100μg/ml。繼續雜交4hour。鮭魚精DNA的作用是封閉NC膜上沒有DNA轉移的位點，降低雜交背景、提高雜交特異性。

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2. 雜交

倒出預雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至42℃的雜交液，同樣加入變性的鮭魚精DNA。將探針100℃加熱5min，使其變性，迅速加到雜交瓶中。42℃雜交過夜。

七、洗膜與檢測

取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜：

2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；
0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。

在洗膜的過程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。實踐證明，當放射強度指示數值較環境背景高1-2倍時，是洗膜的終止點。上述洗膜過程無論在哪一步達到終點，都必須停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水份，并用保鮮膜包裹，注意保鮮膜與NC膜之間不能有氣泡。將膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏），在暗室的紅光下，貼覆兩張X光片，每一片都用透明膠帶固定，合上暗盒，置-70℃低溫冰箱中曝光。根據信號強弱決定曝光時間，一般在1-3天時間。洗片時，先洗一張X光片，若感光偏弱，則再多加兩天曝光時間，再洗第二張片子。

影響Southern雜交實驗的因素很多，主要有：DNA純度、酶切效率、電泳分離效果、轉移效率、探針比活性和洗膜終止點等。

常見問題

Q1：探針標記物的分類有幾種？
A1：（1）探針標記物有放射性核素與非放射性物質兩種。放射性核素標記敏感性高，可檢測pg水平的核酸，但因不易長期保存，且存在放射性污染等問題，現已較少應用。
    （2）非放射性物質常用的有*等，非放射性探針安全、穩定、操作方便并且經濟，但敏感性較低，近年來，由于雜交信號檢測方法的改進，檢測的敏感性得到了很大提高。

Q2：怎樣確定探針的濃度？
A2：總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜核酸分子雜交中放射性核素標記探針與非放射性標記探針的用量分別為5-10 ng/ml和25-1000 ng/ml，而原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.5-5.0 μg/ml。
Q3：如何選擇核酸分子雜交的zui適溫度？
A3：核酸分子雜交技術zui重要的因素之一是選擇zui適的核酸分子雜交反應溫度。若反應溫度低于Tm 10-15 ℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩定的雙鏈，錯配對減少。若反應溫度再低（Tm-30 ℃），雖然互補鏈之間也可形成穩定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗，即zui適復性溫度、苛刻復性溫度及非苛刻復性溫度。zui適復性溫度：Tor =Tm–25 ℃苛刻復性溫度：Ts = Tm – (10或15 ℃)非苛刻復性溫度：Tns =Tm – (30或35 ℃)

Q4：核酸雜交篩選寡核苷酸探針遵循哪些原則？
A4：（1）長18-50 nt，較長探針雜交時間較長，合成量低；較短探針特異性會差些。 
　  （2）堿基成分：G+C含量為40%-60%，超出此范圍則會增加非特異核酸雜交。 
　  （3）探針分子內不應存在互補區，否則會出現抑制探針雜交的“發夾”狀結構。 
　  （4）避免單一堿基的重復出現（不能多于4個），如-CCCCC-。
    （5）一旦選定某一序列符合上述標準，將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區域的同源性不能超過70%或有連續8個或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。

Q5：合成的寡核苷酸探針具有哪些優點？
A5：（1）由于鏈短，其序列復雜度低，分子量小，所以和等量靶位點*雜交的時間比克隆探針短，如20 nt的寡核苷酸探針在濃度為100 ng/ml，靶序列為1-100 pg、1 kb片段時，達到zui大程度的核酸分子雜交只需10 min，而用2 kb的克隆探針在同樣條件下達到*核酸分子雜交則需16 hour。
    （2）寡核苷酸探針可識別靶序列內1個堿基的變化，因為短探針中堿基的錯配能大幅度地降低雜交體的Tm值。
    （3）一次可大量合成寡核苷酸探針（1-10 mg），使得這種探針價格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學或化學方法修飾以進行非放射性標記物的標記。盡管克隆探針較特異，但通過細心篩選序列或選擇相對長的序列（＞30 nt）也可設計出非常特異的寡核苷酸探針。zui常用的寡核苷酸探針有18-40個堿基，目前的合成儀可有效地合成至少50個堿基的探針。