流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒說明書   

1.試劑盒簡介貨

流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒主要感染當年草魚種和青魚，死亡率可達80%以上。其它淡水鯉科魚，如鰱魚、鳙魚、鯽魚、鯉魚感染后沒有臨床癥狀，但可以攜帶病毒到處傳播。該病在水溫高于20℃以上時流行, 25～28℃為流行高峰。常見的臨床癥狀為眼突出、體色發黑，口腔、鰓蓋和鰭條基部出血。撕開表皮，可見肌肉出現點狀或塊狀出血。剖檢腹腔, 可見腸道充血, 肝、脾充血或因失血而發白。病原為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）,是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）的成員。病毒為直徑70nm的球形顆粒，有雙層衣殼，無囊膜，含有11個片段的雙鏈RNA。根據片段長度大小分為大（L1、L2、L3，大小在4.0kb～3.7kb）、中（M4、M5、M6，大小在2.5～2.0kb）、小（S7、S8、S9、S10、S11, 大小在1.6～1.0kb) 三組。在不同地區存在抗原性、核酸電泳圖譜、對細胞的敏感性和對魚的毒力都有一定差異的毒株。多年研究已經確定的有二個典型的代表株：GCRV-873為湖南株，能在CO、CIK等細胞中大量增殖并出現CPE，癥狀以內臟出血為主；GCRV-9014為湖北株，能在CIK、CO細胞中大量增殖，但不產生CPE，癥狀以肌肉出血為主。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到81%。為了適應草魚出血病（GCRV）快速檢測和疫病研究的需要，本公司嚴格依據SN/T3584-2013草血病檢疫技術規范規定的檢測GCRV-9014株病毒的引物序列及其循環參數等技術標準，在本公司嚴謹的產品質量保證體系管控下生產和質檢。確保本試劑盒滿足標準的檢測要求。本試劑盒具有快速靈敏、特異、準確、安全、操作簡單、應用廣泛等特點及優點。

2、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴增試劑。具體組成參見表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體積

核酸提取試劑： 核酸裂解液 15ml×2 管

核酸擴增試劑： DEPC 水

GCRV-9014 RT-PCR 反應液

酶混合物陰性對照

GCRV-9014 陽性對照 1ml×1 管

750µL×1 管

60µL×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

（注：核酸提取試劑可使用本公司生產的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）

3、樣本采集,存放及運輸

3.1樣本采集：所用取樣器材必須經高壓滅菌并烘干。

取新鮮魚類組織臟器（肝、腦、脾、腎）2g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加 5ml PBS 混勻，2 000r/min 離心 10min 取上清轉入無菌離心管中備用。或取有可疑細胞病變的細胞懸液用于檢測。

3.2存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應不超過 24 h；-70 ℃以下可長期保存，但應避免反復凍融（Z多凍融 3 次）。

3.3運輸：采用冰或泡沫箱加冰密封進行運輸。

4、一步法 RT-PCR 檢測

4.1操作方法

4.1.1樣本的處理（在樣本制備區進行）：

4.1.1.1取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標出），做標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)

4.1.1.2每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L，一份樣本換用一個吸頭，再加入 200 ?L 氯，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強烈，以免產生乳化層，也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。

4.1.1.3取與 4.1.1.1 相同數量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預冷）， 做標記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉移至相應的管中，上清液應至少吸取 500?L，不能吸出中間層，顛倒混勻。

4.1.1.4于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 ?L 75％ 乙醇，顛倒洗滌。

4.1.1.5于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。

4.1.1.64 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過于干燥，以免 RNA 不溶。

4.1.1.7加入 11 ?L DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存備用。提取的 RNA 須在 2 h 內進行 PCR 擴增；若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取核酸】。

注：提取的 RNA 須在 2 h 內進行 PCR 擴增；若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內。

4.2、試劑準備

4.2.1擴增試劑準備（在反應混合物配制區進行）：

從試劑盒中取出相應的一步法RT-PCR反應液、RT-PCR混合酶，在室溫下融化后，2 000 r/min 離心5 s。設所需一步法RT-PCR檢測總數為n，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個樣品測試反應體系配制見下表2。

表 2 每個樣品測試反應體系配制表

試劑 RT-PCR 反應液 RT-PCR 混合酶

用量 15 μL 1.0 μL

根據測試樣品的數量計算好各試劑的使用量，加入到適當體積試管中，充分混合均勻，向每個一步法RT-PCR管中各分裝15 μL，轉移至樣本處理區。

4.2.2加樣（在樣本處理區進行）：

在各設定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL，蓋緊管蓋，500 r/min離心30s。

4.3、檢測（在檢測區進行）：

將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內，記錄樣本擺放順序。循環條件設置如下： 階段：42 oC/30 min；

第二階段：94 oC/4 min；

第三階段：94 oC/1 min, 55 oC/1 min，72 oC/1 min, 30個循環； 第四階段，72 oC/8 min；

第五階段，4 oC 保存。

4.4、瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將10μL樣品PCR擴增產物和相應電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時設立DNA標準分子量作對照。5 V/cm電泳約0.5 h，當溴酚藍到達底部時停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增初預期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄。

5、結果判定

5.1一步法RT-PCR后陽性對照出現一條320bp的DNA段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。

5.2待測樣品在相應 320 bp DNA 位置上有帶，可判陽性。

6、相關技術信息

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3’