魚類神經壞死病毒（VNN）熒光PCR法【儲存條件及有效期】

1．避光-20℃儲存，有效期 12 個月。

2．低溫運輸不能超過 4 天；開封后避光-20℃儲存，對有效期沒有影響。避免反復凍融，凍融 6 次不影響檢測效果。

3．生產日期、有效期至：見外包裝盒。

【適用儀器】

適用于 ABI 7500、Bio-Rad CFX96、Roche480 等全自動熒光PCR 檢測儀。

【樣本要求】

1．樣本種類：鼻/咽拭子、痰液、支氣管肺泡灌洗液；培養物等樣品。

2．保存條件：采集的標本應及時送檢，24 小時內檢測的應 4℃保存，超過 24 小時的最好-70℃保存，并避免反復凍融。

【檢測方法】

1 ． 試劑準備（試劑準備區）

將試劑盒各組分置 4℃避光融化，充分混勻后瞬間離心。計算試劑使用份數 N（N=樣本數+1 管陽性對照+1 管陰性對照），根據下表配置反應體系mix，加入一適當體積離心管中，充分混勻后瞬間離心，按 20μL 分裝至 PCR 反應管/板，并轉移至樣本處理區。

【結果分析條件設定】：

u 基線（Baseline）設定：應選擇該次實驗指數擴增前所有樣本熒光信號比較穩定的一段區域（所有樣本熒光信號無較大波動），起始點（Start）應避開熒光采集起始階段的信號波動，終止點（End）應比最早出現指數擴增的樣本Ct值減少1~3個循環，建議基線設為6~15。

u 閾值(Threshold)設定：將閾值線設定在剛好超過正常陰性質控品擴增曲線的最高點。

【質控標準】：

1.   陰性質控品的檢測結果應為陰性，無指數擴增期，Ct=40或無Ct；

2.   陽性質控品的檢測結果應為陽性，有明顯的指數擴增期，Ct值應小于等于35；

3.   以上要求需在一次實驗中同時滿足，否則該次實驗視為無效。

【結果判斷】：

1.   陽性：有明顯的指數擴增期，且Ct＜38；

2.可疑：有明顯的指數擴增期，且38≤Ct<40，此時樣本為可疑樣本；對于可疑樣本建議復核一次，若復核結果Ct<40且有指數擴增期，則判定為陽性，否則判定為陰性；

3.   陰性：無指數擴增期，Ct=40或無Ct值均判定為陰性樣本。

【注意事項】：

             1．PCR 操作各階段應嚴格分區操作，避免交叉污染。

             2．試劑盒各組分使用前應充分融化混勻，離心數秒后使用。

             3．各組分不得與其他產品或不同批號的相應成分進行互換。

             4．待測標本若不及時檢測，應保存于-20℃或-70℃。

             5．樣品的處理應該嚴格按照生物安全規范操作。

             6．PCR 操作人員應具有經驗和受過專業培訓。

             7．本試劑盒僅用于科研使用，不做為臨床診斷使用。

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