自養無枝酸菌探針法熒光定量PCR試劑盒說明書

1、 試劑盒簡介貨為了適應自養無枝酸菌探針法快速檢測和疫病研究的需要，本公司參照 OIE 標準中規定的引物序列，經多次實驗及系統優化，開發了本試劑盒。應用本試劑盒進行檢測具有快速、靈敏、特異、準確、安全操作簡單、應用廣泛和高通量檢測等特點及優點。2、試劑盒組成:

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。

3、樣本采集，存放及運輸

3.1 樣本采集

所用取樣器材必須經過高壓滅菌并烘干。取對蝦的腮絲、肝胰腺、腹肢等組織各30mg標記后置于離心管中，按照試劑盒配套的DNA抽提試劑盒操作說明提取DNA模板。

3.2 存放

研磨后的樣本應盡快提取 DNA；待測樣本應避免凍融。

3.3 運輸

采用或泡沫箱加冰密封進行運輸。

4、檢測步驟

4.1.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區進行)：
取 n 個 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數和一管陰性對照之和，對每個管進行編號標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)

4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl，一份樣本換用一個吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min。

4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃ 條件下，2 000 r/min 離心 10 s。

4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清， 即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內進行 PCR 擴增或放置于-70℃冰箱內保存）。

4.1 PCR 檢測

4.1.1 擴增試劑準備（在反應混合物配制區進行）：

從試劑盒中取出相應的 PCR 反應液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個樣品測試反應體系配制見下表 2。

表 2 每個樣品測試反應體系配制表

4.1.2 加樣（樣本處理區進行）：

向每個 PCR 管孔中各分裝 15μL 的混合液，再分別加入樣本 DNA 模板 10μL，蓋緊管蓋，500

r/min 離心 30 s。

4.1.3 PCR 檢測（在檢測區進行）： 階段，95 ℃/3 min；

第二階段，94 ℃/30 sec，60 ℃/30sec；72℃/1 min；35個循環；

第三階段，72 ℃/7 min； 第四階段，4 ℃ 保存

4.3 瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備 1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好沒過膠面，向 PCR 擴增產物中加入 1/6 體積的電泳上樣緩沖液（6X 上樣緩沖液），按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時設立 DNA DL2000 Marker 做對照。5 V/cm 電泳約 0.5h，當溴酚藍到達一定位置時停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增出預期的特異性 DNA 電泳帶，拍攝并記錄。

5、結果判定

5.1 PCR 后，陽性對照會出現一條 196bp 的 DNA段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。

5.2 待測樣品 PCR 擴增后能在相應 196 bp DNA 位置上有帶，可判為 BP 核酸陽性。

6、相關技術信息

F: 5’-GAT-CTG-CAA-GAG-GAC-AAA-CC-3’

R: 5’-TAC-CCT-GCA-TTC-CTT-GTC-GC-3’