豬瘟病毒疫苗株染料法熒光定量RT-PCR試劑盒說明書

1、試劑盒簡介貨為了適應豬瘟病毒疫苗株染料法熒光定量RT-PCR試劑盒快速檢測和疫病研究的需要，本公司參照 OIE 國際標準中規(guī)定的引物序列，經多次實驗及系統優(yōu)化，開發(fā)了本試劑盒。應用本試劑盒進行檢測具有快速、靈敏、特異、準確、安全操作簡單、應用廣泛和高通量檢測等特點及優(yōu)點。2、試劑盒組成:

試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴增試劑，具體組成參見表 1：s

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成及試劑配制：

1.  酶聯板（Assay plate ）：一塊（96孔）。 
2. 標準品（Standard）：2瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶
4. 生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

樣本處理及要求：
1.   血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.  組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

反應五要素：

參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC*隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。

引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

操作流程:

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

樣本：血清 血漿 組織勻漿等液體樣本

標記物：血清 血漿 組織勻漿等

應用：僅用科研實驗檢測定量，定性檢

檢測方法：夾心法

技術要求：全程按說明書步驟檢測，操作規(guī)范，專業(yè)，儀器設備齊全。

規(guī)格：48t/96t 

性狀：液體 

運輸方式：快遞發(fā)貨 

有效期：6個月品

特點：靈敏性高，---性，吸附均勻，吸附性好，回收利用率高，是一款可以讓您放心選購的產品。

使用范圍：此產品供科研實驗使用，不得用于---。

用途：用于測定人血清、血漿、組織及相關液體樣本中的含量或活性。

注意事項:

1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

2.各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

3.請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔di一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）。

4.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5.底物請避光保存。

6.嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

7.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

8.本試劑不同批號組分不得混用。

9.不能使用過期產品。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。 

每個樣品測試反應體系配制見下表 2。

表 2 每個樣品測試反應體系配制表

注：本公司提供試劑盒免費代測服務。需要其他檢測試劑盒請咨詢銷售人員。