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上海撫生實(shí)業(yè)有限公司
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PCR對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好,目的片段不理想分析

時(shí)間:2023/7/17閱讀:226
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對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好,卻沒(méi)有回收到目的片段,實(shí)驗(yàn)出了什么問(wèn)題?

  參考見解:

  1 連接用室溫保溫1小時(shí),能滿足大多數(shù)克隆,為提高效率,需4oC過(guò)夜。

  2 插入片段帶有污染,使3`-T缺失,或抑制連接,抑制轉(zhuǎn)化。為此,將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合,再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù),插入片段需純化,或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。

  3 插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段,因受UV過(guò)度照射,時(shí)有發(fā)生。UV過(guò)度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體,不利于連接,DNA必需重新純化。

  4 帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無(wú)A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料(TM042)。

  5高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定,在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排,如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排,需用重組缺陷大腸桿菌菌株,如SURE細(xì)胞。

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