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PCR對照實驗結果好,目的片段不理想分析

時間:2023/7/17閱讀:227
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對照實驗結果好,卻沒有回收到目的片段,實驗出了什么問題?

  參考見解:

  1 連接用室溫保溫1小時,能滿足大多數克隆,為提高效率,需4oC過夜。

  2 插入片段帶有污染,使3`-T缺失,或抑制連接,抑制轉化。為此,將插入片段和pGEM-T正對照混合,再連接。如降低了對照的菌落數,插入片段需純化,或重新制備。如產生大量的藍斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。

  3 插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段,因受UV過度照射,時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體,不利于連接,DNA必需重新純化。

  4 帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料(TM042)。

  5高度重復序列可能會不穩定,在擴增中產生缺失和重排,如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排,需用重組缺陷大腸桿菌菌株,如SURE細胞。

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