1、變性溫度與時間

模板變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不wan全，DNA雙鏈會很快復性，因而減少產量。變性溫度太高，又會影響酶的活性，一般情況下可設為94℃ 20-30秒，高溫時間應盡量縮短，以保持耐熱DNA聚合酶的活力，最高變性溫度不宜超過95℃。

2、退火溫度與時間

退火溫度決定PCR特異性與產量。溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降；溫度低產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。合適的退火溫度一般在45-68℃之間。設置特定反應的最適退火溫度，可根據引物的（G+C）%含量進行推測，一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時間一般為30-60秒，足以使引物與模板之間結合，沒有必要長時間退火。

3、延伸溫度與時間

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70-75℃之間，延伸時間根據所有聚合酶擴增速度和擴增片段大小設定。如同樣擴增2kb片段，若使用Taq酶只需要1分鐘，使用Pfu酶則應設定2分鐘以上。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。時間太短則可能得不到擴增產物或得到一些短的非特異性片段。

4、循環次數

可根據模板DNA的量，擴增片段的大小和擴增產物的下步應用等因素，設定30-40個循環。循環次數太少，擴增量不足，如果循環次數太多，錯配幾率會增加，非特異性背景嚴重。所以，在保證產物得率的前提下，應盡量減少循環次數。