ELISA試劑盒時(shí)就面對(duì)許多艱難，雖然有師兄師姐鋪路，但仍是常常做得烏煙瘴氣，比如說花板，假陽性，全顯色，悉數(shù)顯色，顯色比空白還低,自個(gè)也為此煩惱過很長(zhǎng)一段時(shí)間，跟著自個(gè)技術(shù)水平得進(jìn)步，或多或少地也把握了ELISA試劑盒體系的脾氣，也是游刃有余吧，如今做方陣，做ELISA試劑盒已是駕輕就熟了，曾經(jīng)檢查一種抗體用整整一下午還算得暈暈的，如今給我十個(gè)八個(gè)的從包被到顯色，一個(gè)作業(yè)日根本搞定。下面就由我拋磚引玉地來說一下，做ELISA的經(jīng)驗(yàn)總結(jié):

 1、包被原的性質(zhì)很首要，蛋白濃度，是不是降解，這到你做出的抗體可不可以被其辨認(rèn)，所以保留抗原很首要，我做重組蛋白時(shí)，師兄都嚴(yán)厲正告我必定要在冰浴下緩慢消融即是這個(gè)道理。還有有的包被原也許不是蛋白，對(duì)于*和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)咱們要事前對(duì)其改造再加以包被，我把辦法扼要的列出如下:①親和素*:先親和素先包被載體，參加*化的DNA，這種包被辦法均勻、結(jié)實(shí)，已擴(kuò)展應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。②脂類物質(zhì):可將其在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中溶解后參加ELISA試劑盒板孔中，開蓋置冰箱guo ye或涼風(fēng)吹干，待酒精蒸發(fā)后，讓脂質(zhì)天然干固在固相外表。③小分子有必要依托和大的蛋白載體偶聯(lián)后才干固定在固相載體上。

 2、ELISA試劑盒包被液的挑選，通常挑選ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時(shí)由于實(shí)驗(yàn)的需要，包被原的特殊性也也許選用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)留意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體外表的疏水基團(tuán)間的效果，這種物理吸附對(duì)錯(cuò)特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體外表。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)還要有鞏固的理論外也要實(shí)踐，看一下終究可不可以應(yīng)用到自個(gè)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中去。常用的包被液除了方才說到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

 3、關(guān)閉：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的進(jìn)程。關(guān)閉即是讓很多不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空地，然后排擠ELISA試劑盒后的過程中攪擾物質(zhì)的再吸附。常用關(guān)閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，對(duì)比價(jià)廉，可以高濃度運(yùn)用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清(首要為了掃除相似蛋白攪擾)和酪蛋白等等。但終究選用啥要依據(jù)。

 4、洗刷板：可以說在ELISA試劑盒操作中，洗刷是zui首要的關(guān)鍵技術(shù)。由于聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為到達(dá)別離游離的和的酶符號(hào)物的意圖，鏟除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的攪擾物質(zhì)，在洗刷時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來。所以在洗板時(shí)會(huì)有必定差錯(cuò)，人為因素很大(當(dāng)然有條件的用洗板機(jī)在外)，洗的不*或串了孔，對(duì)如此活絡(luò)的ELISA試劑盒體系可是不小的影響。

 5、ELISA試劑盒加抗體標(biāo)本(和二抗):留意該換槍頭時(shí)換槍頭。標(biāo)本稀釋通常可用pbs稀釋，也可用關(guān)閉液去稀釋。如需加二抗，還要留意二抗的作業(yè)濃度，太高浪費(fèi)，太低則上色淺。