ELISA試劑盒中一般有二次抗原抗體反應，即加標本后和加結合物后，此時反應的溫度和時間應按規定的要求，保溫容器是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA試劑盒板不應疊在一起。為避免蒸發，板上應加蓋，或將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應預先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要。加入底物后，反應的時間和溫度通常不做嚴格要求，如室溫高于20℃。

  ELISA試劑盒板可避光放在實驗臺上，以便不時觀察，待對照管顯色適當時，即可終止酶反應ELISA試劑盒測定中的優劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本，將它們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA試劑盒，然后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別zui大，這種載體就是這一ELISA試劑盒測定項目的zui合適的固相載體。

   ELISA試劑盒板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA試劑盒板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產品的質量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA試劑盒板各孔，洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后，分別測每孔溶液的吸光度。控制反應條件，使各孔讀數在吸光度0.8左右。計算全部讀數的平均值。所有單個讀數與全部讀數的均數之差，應小于10%。ELISA試劑盒板的洗滌一般可采用以下方法：①吸干孔內反應液;②將洗滌液注滿板孔;③放置2min，略作搖動;④吸干孔內液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數一般為3～4次，有時甚至需洗5～6次。