當前位置:上海滬鼎生物科技有限公司>>技術文章>>細胞凍存實驗的實驗步驟
實驗原理:
在不附加任何條件下直接凍存細胞時,細胞內(nèi)外環(huán)境中的水會結(jié)成冰晶,能導致細胞發(fā)生一系列變化,如機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH 改變、蛋白質(zhì)變性等等,終導致細胞死亡。但如向細胞培養(yǎng)液中加入保護劑甘油或二甲基亞砜(DMSO),可使冰點降低,在緩慢的凍結(jié)條件下,能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外,可避免上述現(xiàn)象的發(fā)生。凍存在-135 ℃以下低溫中,能減少冰晶的形成。而融化細胞時速度則要快,使之迅速通過易受損的-5~0 ℃以后,細胞活力不受損害,仍能生長增殖。當前常用的保護劑仍為甘油和DMSO,它們對細胞無毒、分子量小、溶解度大、易穿透細胞,使用范圍在5%~15 %之間,常用10 %。
實驗步驟:
1.細胞
選項對數(shù)生長期細胞;收集細胞24 小時前換液一次;
2、制備細胞懸液:
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(1)用75%酒精棉球消毒超凈工作臺臺面,然后用75%酒精棉球消毒雙手及暴露部位;
(2)用75%酒精棉球消毒各培養(yǎng)用液的瓶蓋以及培養(yǎng)瓶瓶蓋部位,并在酒精燈外焰上方一過,擰開瓶蓋,將瓶口再在酒精燈外焰上方一過后,擰上瓶蓋,但不要擰緊,以便下步操作;?
(3)輕輕將細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液倒入燒杯中,注意不要讓瓶口碰到燒杯,不要讓液體濺出;
(4)吸取PE液3ml加入瓶內(nèi),加入時注意從側(cè)面加入而不能直接沖細胞貼壁處,避免造成細胞脫壁,然后蓋上蓋子,平放輕搖40下,輕輕倒出,要求倒干凈;
(5)加入0.3ml的0.25%胰蛋白酶液,加入時直沖細胞貼壁處,平放輕搖,使酶液漫過整個瓶底部,一分鐘之內(nèi)將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡臺上進行觀察,可發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)漸漸回縮,細胞間隙增大,細胞慢慢變圓,用手掌拍打瓶底和瓶側(cè),使細胞從瓶壁上脫落下來并分散,呈懸浮狀;
(6)立即加入5mlMEM+10%小牛血清,用吸管向瓶壁輕輕吹吸幾次,從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束,以確保所有底部都被吹到,使細胞全部從瓶壁脫落并形成均勻的細胞懸液;
3、按常規(guī)法把細胞制成細胞懸液,計數(shù)、令細胞密度達5×106 /ml (如一瓶細胞數(shù)量不足則用兩瓶或更多的細胞),離心去上清, 吸入離心管中;先用培養(yǎng)液9 分+DMSO 1 分(或甘油)配成10%的DMSO凍存液;按上法一滴滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸;分裝入無菌安瓿中,每安瓿加1.5 毫升細胞懸液;
4、封口
用塑料安瓿時擰緊瓶口即可;如用火焰封閉安瓿口后,仔細檢查,定要封嚴,必要時可浸入藍色液中觀察,為安全起見,把安瓿縫入紗布小袋中,以防液氮浸入后,融解時因受熱發(fā)生爆炸傷人;紗袋一端系以線繩,末端扎有小牌,注明:細胞名稱,凍存日期,以便日后查找;
5、凍存
當前已有細胞凍存器;在無凍存器的情況下,可用手工辦法;從把凍存物懸在液氮罐口開始算起,按-1 ℃分鐘速度,在30~40 分鐘內(nèi),下降到液氮面,再停30 分鐘后,直投入液氮中。
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