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細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟

時(shí)間:2020/1/16閱讀:1224
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    實(shí)驗(yàn)原理:

    在不附加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí),細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的水會(huì)結(jié)成冰晶,能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列變化,如機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH 改變、蛋白質(zhì)變性等等,終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但如向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜(DMSO),可使冰點(diǎn)降低,在緩慢的凍結(jié)條件下,能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外,可避免上述現(xiàn)象的發(fā)生。凍存在-135 ℃以下低溫中,能減少冰晶的形成。而融化細(xì)胞時(shí)速度則要快,使之迅速通過易受損的-5~0 ℃以后,細(xì)胞活力不受損害,仍能生長(zhǎng)增殖。當(dāng)前常用的保護(hù)劑仍為甘油和DMSO,它們對(duì)細(xì)胞無毒、分子量小、溶解度大、易穿透細(xì)胞,使用范圍在5%~15 %之間,常用10 %。

    實(shí)驗(yàn)步驟:

    1.細(xì)胞

    選項(xiàng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞;收集細(xì)胞24 小時(shí)前換液一次;

    2、制備細(xì)胞懸液:
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    (1)用75%酒精棉球消毒超凈工作臺(tái)臺(tái)面,然后用75%酒精棉球消毒雙手及暴露部位;

    (2)用75%酒精棉球消毒各培養(yǎng)用液的瓶蓋以及培養(yǎng)瓶瓶蓋部位,并在酒精燈外焰上方一過,擰開瓶蓋,將瓶口再在酒精燈外焰上方一過后,擰上瓶蓋,但不要擰緊,以便下步操作;?

    (3)輕輕將細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液倒入燒杯中,注意不要讓瓶口碰到燒杯,不要讓液體濺出;

    (4)吸取PE液3ml加入瓶?jī)?nèi),加入時(shí)注意從側(cè)面加入而不能直接沖細(xì)胞貼壁處,避免造成細(xì)胞脫壁,然后蓋上蓋子,平放輕搖40下,輕輕倒出,要求倒干凈;

    (5)加入0.3ml的0.25%胰蛋白酶液,加入時(shí)直沖細(xì)胞貼壁處,平放輕搖,使酶液漫過整個(gè)瓶底部,一分鐘之內(nèi)將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡臺(tái)上進(jìn)行觀察,可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)漸漸回縮,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞慢慢變圓,用手掌拍打瓶底和瓶側(cè),使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來并分散,呈懸浮狀;

    (6)立即加入5mlMEM+10%小牛血清,用吸管向瓶壁輕輕吹吸幾次,從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束,以確保所有底部都被吹到,使細(xì)胞全部從瓶壁脫落并形成均勻的細(xì)胞懸液;

    3、按常規(guī)法把細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)、令細(xì)胞密度達(dá)5×106 /ml (如一瓶細(xì)胞數(shù)量不足則用兩瓶或更多的細(xì)胞),離心去上清, 吸入離心管中;先用培養(yǎng)液9 分+DMSO 1 分(或甘油)配成10%的DMSO凍存液;按上法一滴滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸;分裝入無菌安瓿中,每安瓿加1.5 毫升細(xì)胞懸液;

    4、封口

    用塑料安瓿時(shí)擰緊瓶口即可;如用火焰封閉安瓿口后,仔細(xì)檢查,定要封嚴(yán),必要時(shí)可浸入藍(lán)色液中觀察,為安全起見,把安瓿縫入紗布小袋中,以防液氮浸入后,融解時(shí)因受熱發(fā)生爆炸傷人;紗袋一端系以線繩,末端扎有小牌,注明:細(xì)胞名稱,凍存日期,以便日后查找;


    5、凍存

    當(dāng)前已有細(xì)胞凍存器;在無凍存器的情況下,可用手工辦法;從把凍存物懸在液氮罐口開始算起,按-1 ℃分鐘速度,在30~40 分鐘內(nèi),下降到液氮面,再停30 分鐘后,直投入液氮中。

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