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PCR操作時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)

時(shí)間:2019/12/24閱讀:863
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    PCR檢測(cè)微量感染因子時(shí),容易因?yàn)槲廴镜亩鴮?dǎo)致各種問(wèn)題,因此,進(jìn)行PCR操作時(shí),操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程,zui大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。

    (1)劃分操作區(qū):目前,普通PCR尚不能做到單人單管,實(shí)現(xiàn)*閉管操作,但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管,均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行:

    ①標(biāo)本處理區(qū),包括擴(kuò)增摸板的制備;

    ②PCR擴(kuò)增區(qū),包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增;

    ③產(chǎn)物分析區(qū),凝膠電泳分析,產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。

    各工作區(qū)要有一定的隔離,操作器材,要有一定的方向性。如:標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。

    切記:產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。

    (2)分裝試劑:PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中,不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來(lái)源的DNA:

    ①PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水;

    ②引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制;

    ③引物和dNTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存,分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間,以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。

    (3) 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一。因此,不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真,在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意:

    ①戴一次性手套,若不小心濺上反應(yīng)液,立即更換手套;

    ②使用一次性吸頭,嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用,吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染;

    ③避免反應(yīng)液飛濺,打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況,開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;

    ④操作多份樣品時(shí),制備反應(yīng)混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應(yīng)的度;

    ⑤zui后加入反應(yīng)模板,加入后蓋緊反應(yīng)管;

    ⑥操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照,即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性,又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性;

    ⑦盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由于加樣器zui容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染,使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該,不能交叉使用,尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū);

    ⑧重復(fù)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證結(jié)果,慎下結(jié)論。

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