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上海金穗生物科技有限公司
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創(chuàng)建輕鏈改組噬菌體文庫

時間:2013-1-10閱讀:154
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[方法]
1.配制50ul PCR反應(yīng)混合液, 包含:
● 水,34.5ul
● 20XdNTP(每種5mmol/L), 2,5ul
● 10XVent聚合酶緩沖液,5.0ul
● LMB3引物(10pmol/u1),2.5ul
● scF討HXhoFOR引物(10pmol/ul),2.5ul
● scFv模板DNA(100ng), 2.0u1
● VentDNA聚合酶(2單位),1.0u1
2.在有加熱蓋的熱循環(huán)儀內(nèi)加熱反應(yīng)混合液到94℃,5分鐘。
3.以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分鐘的條件共循環(huán)25次,擴(kuò)增VH基因。
4.用Wizard PCR純化試劑盒芝之PCR產(chǎn)物。
5.用XhoI和NcoI消化PCR產(chǎn)物;但除了用XhoI替代 NcoI,還需在NEB2緩沖液中進(jìn)行消化。
6.制備VL基因文庫載體;但需用XhoI和NcoI消化載體.
7.連接已消化的PCR產(chǎn)物和已消化的載體,并電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中,構(gòu)建輕鏈改組文庫。

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