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簡介編輯

DNA測序技術，又叫基因測序技術。

人類基因組這部由A、T、G、C四個字母組成的卷帙浩繁的生命天書如同一座寶庫，保藏著幾千年來人們迫切想知道的秘密，DNA測序技術就好似“芝麻開門"這樣的咒語，是我們打開寶庫的金鑰匙世界上*個測定DNA序列的方法是由英國生化學家弗雷德里克·桑格爾發明的。自此DNA測序的速度就一直呈加速態勢。2001年人類基因組草圖耗資4.37億美元，耗時13年。到了2007年，*個完整人類基因組序列圖譜的誕生只花費了150萬美元，3個月就搞定。2009年1月2日，美國加州太平洋生物科學公司的科學家喬納斯·考爾拉赫、斯蒂芬·特納及其研究小組在《科學》雜志上發表論文稱，他們將納米技術與芯片技術相結合，發明了一種新型測序方法，速度是現有技術的3萬倍。

DNA sequencing technology

Sanger 法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入*的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X- 光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

非同位素銀染測序系統操作技術

Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成后經90分鐘就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。

DNA測序策略

Taq DNA聚合酶在95℃時*的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品，對于雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的準確性，能產生均一的條帶，且背景低。

SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。

退火溫度是熱循環測序中zui重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物(<500bp)得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始于每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對于有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到*結果。

由于本系統采用熱循環裝置, 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03-- 2pmol模板DNA, 隨模板種類而定。(2). 在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA(dsDNA)模板的堿變性及乙醇沉淀過程，變性循環也有助于消除由于線性dsDNA模板(如PCR反應產物)快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。

2材料

待測已提純的DNA，可為單鏈，也可為雙鏈。

科學家在一個蝕刻有納米結構的微陣列芯片上放置了數以千計的波導管。這是一種微型、中空的金屬管，直徑大約20納米，體積大約是1毫微微微升，一個DNA分子外加一個DNA多聚酶分子便可將管內空間占滿。這樣一來，僅在一塊小小的芯片上，就能同時進行數千個測序反應。尤其可貴的是，在這種微型波導管中進行測序反應時，干擾會顯著減少，也就是說可以大幅提高度。

目前的產品中，每個芯片上的波導管大約有3000個，太平洋生物科學公司打算2010年推出這一級別的產品。據公司創始人特納預計，到2013年，將實現每張芯片放置一百萬個波導管，屆時將能在半小時內測完人類基因組全序列，度達到99.999%，花費低于1000美元。

盡管美國得克薩斯州貝勒醫學院的邁克爾·梅茲克博士表示特納的展望過于樂觀，但這樣驚人的速度讓我們仿佛看到了計算機CPU曾經的前進步伐——集成電路上容納的晶體管數目，每18個月就會增加一倍，性能也將提升一倍。有人評論道，DNA測序技術將跟隨計算機技術和通訊技術成為第三個“摩爾定律化"的學科產業。

3設備

DNA測序儀，性能特點，自動化程度高，提供連續、無需監控的操作，自動灌膠、上樣、電泳分離、檢測及數據分析，可連續運行24小時無需人工干預。樣品分析量大，一束毛細管可同時對16個樣品進行全自動分析，一天可完成數百個樣品的測序或片段分析工作。*的熒光檢測系統，采用光柵分光，CCD攝像機成像技術，實現多色熒光同時檢測，與傳統的濾鏡及光電倍增管的檢測方式相比，光柵及CCD的優勢在于更新熒光化學時無需更換任何硬件設備。從激光光源發出的光線被光學元件分成兩股，16根毛細管被一束激光同時從兩面照射，有效提高熒光檢測靈敏度和均一性。DNA測序儀在2011年前多由美國生產。

2011年4月18日，由中科院北京基因組研究所與中科院半導體研究所承擔的“模塊化DNA分析系統"項目通過評審驗收。這標志著我國在第二代DNA測序儀研發方面，形成了具有自主知識產權的高通量DNA測序技術及其系統樣機。日前，驗收組對該項目進行了測試和驗收考核。驗收組認為，此項目完成了儀器研制項目實施方案所要求的各項技術指標，有效測序片段數量、平均讀長和有效序列數據總產量等關鍵技術性能指標遠遠優于立項指標，該成果實現了與主流設備性能相當的國產化DNA測序能力，在基因組學、生物信息學，乃至生命科學諸多方向的基礎研究和應用研究方面具有重要實用價值。項目負責人、中科院北京基因組所副所長于軍表示，計劃下一步將繼續開發適應于我國科研需求的下一代測序儀、配套試劑、芯片和測序分析軟件等，使這一設備全面實現系統功能。

高壓電泳儀，測序用電泳槽，制膠設備，PCR儀。

4試劑

（1）SILVER SEQUENCETM DNA測序試劑盒。

（2）丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺儲備液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉雙丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉雙丙烯酰胺溶于140ml 雙蒸水中，定容至250ml，0.45mm過濾器過濾后，貯于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。

DNA測序技術

（3）10%過硫酸銨，0.5g過硫酸銨溶于4ml水中，定容至5ml，應新配新用。

（4）10×TBE緩沖液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶于雙蒸水中定容至1升，置于4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。

（5）TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。

（6）TEMED

（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升備用。

（8）染色溶液：*2克，甲醛3ml，溶于2升超純水中備用。

（9）顯影溶液：60克碳酸鈉（Na2CO3)溶于2升超純水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml*溶液（10mg/ml)。

（10）95%乙醇。

（11）0.5%冰乙酸。

（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。

5操作

成功地使用銀染測序系統需要對提供的操作方法進行仔細考慮。銀染不如放射性檢測法靈敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通過延長X-光膠片曝光時間的方法增加信號強度。因此，請使用*的DNA模板量, 每次均使用所提供的對照檢查系統的可靠性，并且注意如下幾點：

（1） DNA的濃度和純度必須經過瓊脂糖凝膠電泳或熒光法測定, 樣品應與已知量DNA一起電泳。

（2） 分光光度法對于很多DNA提取物包括質粒小量制備來說，并不能給出一個可信的DNA濃度估計，混雜的染色體DNA、蛋白、RNA、有機物及無機化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常錯誤地高估DNA濃度。

DNA測序儀

（3） DNA制備過程中用核糖核酸酶處理所產生核糖核苷酸，雖然它們在電泳后DNA樣品的前面，并不能觀察到，但它們仍會有260nm光吸收。

測序反應

1. 對于每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃備用。

2. 對于每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑：

（1） 樣品反應：

質粒模板DNA 2.1pmol

5×測序緩沖液 5ml

引物 4.5pmol

無菌ddH2O 至終體積16ml

（2）對照反應

pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg)　 4.0ml

5×測序緩沖液 5ml

pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml

無菌ddH2 O 至終體積 16 ml

3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。

4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。

5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。

6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以[注意]中循環模式為基準，開始循環程序。對于每個引物/模板組合都必須選擇*退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350堿基的長度。

7. 熱循環程序完成后，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。

[注意] 1、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：

模板種類/長度 模板量

200bp (PCR產物) 16ng(120fmol)

3000-5000bp（超螺旋質粒DNA) 4mg (2pmol)

48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)

由于超螺旋質粒產生的信號比松弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。

2、計算與4.5pmol相當的引物納克數可用以下一般公式：

4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物堿基數

計算與1pmol相當的引物微克數可用以下一般公式：

dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基對數

ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基數

3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。

模式1：適用于引物<24堿基或GC含量<50%

95℃ 2分鐘。然后： 95℃ 30秒(變性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分鐘(延伸)。

模式2:適用于≥24堿基或略短的GC含量≥50%的引物。

95℃ 2分鐘, 然后: 95℃ 30秒(變性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入終止溶液之后樣品可在4℃保存過夜。

測序凝膠板的制備

玻璃板的處理

銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，zui后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高(棕色)。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯于玻璃板上。這一步對于在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。

短玻璃板的處理

A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。

B. 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過并已經自然干燥的玻璃板, 整個板面都必須擦拭。

C. 4-5分鐘后, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多余的粘合溶液。

[注意] 1. 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷, 使凝膠不能很好地粘附。

2. 準備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。

3、防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的, 否則將導致凝膠撕裂。

長玻璃板的處理

A. 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。

B. 5-10分鐘后用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。

[注意] 1. 用過的凝膠可在水中浸泡后用剃須刀片或塑料刮去。玻璃板須用去污劑*清洗。或者凝膠用10% NaOH浸泡后除去。為防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開, 如果出現交叉污染, 以后制備的凝膠可能撕裂或變得松弛。

凝膠的制備

（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote處理后，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置于玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓于其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。

（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結果。配制過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2ml，并用0.45mm的濾膜過濾，然后加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液*冷卻后，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制后4-6分鐘，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的 TEMED和過硫酸銨。

凝膠終濃度

3 4 5 6 8 12 16 18

尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0

Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0

10×TBE緩沖液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0

雙蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0

10%過硫酸銨(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7

TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40

(3)膠配制好后，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，靜止放置使之聚合*。

[注意] 1、使用夾子固定玻璃板時，夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現漏膠液現象。

2、灌制凝膠的過程中要嚴防產生氣泡，否則影響測序的結果。

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