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貨號	FS-X9671

培養操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養板（每孔一片）或培養皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經過計數的細胞懸浮液移入培養板中，使蓋玻片*浸在培養液中；

5．將培養板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養板底部2/3面積時，將培養板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

中文名稱：Hoechst 33258染色液

英文名稱：

產品規格：1mL

貨號：FS-X9671

產品介紹:

Hoechst 33258，也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258，是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低。Hoechst 33258染色常用于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。Hoechst 33258也常用于普通的細胞核染色，或常規的DNA染色。Hoechst 33258的大激發波長為346nm，大發射波長為460nm;Hoechst 33258和雙鏈DNA結合后，大激發波長為352nm，大發射波長為461nm。本Hoechst 33258染色液可直接用于固定細胞或組織的細胞核染色，也可直接用于活細胞或組織的細胞核染色。

使用說明：

使用前用生理鹽水或PBS將Hoechst 33258染色液稀釋100倍，即為工作液。

1. 對于固定的細胞或組織：

a. 對于細胞或組織樣品，固定后，適當洗滌去除固定劑。隨后如果需要進行免疫熒光染色，則先進行免疫熒光染色，染色完畢后再按后續步驟進行Hoechst 33258染色。如果不需要進行其它染色，則直接進行后續的Hoechst 33258染色。

b. 對于貼壁細胞或組織切片，加入少量Hoechst 33258工作液，覆蓋住樣品即可;對于懸浮細胞，至少加入待染色樣品3倍體積的工作液，混勻。室溫放置3-5分鐘。

c. 吸除Hoechst 33258染色液，用TBST、PBS或生理鹽水洗滌2-3次，每次3-5分鐘。

d. 直接在熒光顯微鏡下觀察或封片后熒光顯微鏡下觀察。細胞發生凋亡時，會看到凋亡細胞的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。

2. 對于活細胞或組織：

a. 加入適當量Hoechst 33258工作液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通常對于六孔板一個孔需加入1mL工作液，對于96孔板一個孔需加入100μL工作液。

b. 在適宜于細胞培養的溫度下培養20-30分鐘。棄染色液，用PBS或培養液洗滌2-3次即可進行熒光檢測。

儲存條件：-20℃避光，有效期一年。

實驗報告：

一、分離與培養：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；

5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

腫瘤相關抗原(TAA)elisa檢測試劑盒英文名稱：TAA ELISA Kit，TAA，

脂質運載蛋白2(LCN2)elisa檢測試劑盒英文名稱：LCN2 ELISA Kit，LCN2，

增殖誘導配體(APRIL)elisa檢測試劑盒英文名稱：APRIL ELISA Kit，APRIL，

游離雌三chun(FE3)elisa檢測試劑盒英文名稱：FE3 ELISA Kit，FE3，

乙酰(ACH)elisa檢測試劑盒英文名稱：ACH ELISA Kit，ACH，

胰蛋白mei原激活肽(TAP)elisa檢測試劑盒英文名稱：TAP ELISA Kit，TAP，

血小板性蛋白(PBP/CXCL7)elisa檢測試劑盒英文名稱：PBP/CXCL7 ELISA Kit，PBP/CXCL7，

血管性血友病因子/瑞斯托霉su輔因子(VWF)elisa檢測試劑盒英文名稱：VWF ELISA Kit，VWF，

Sestrin2蛋白(SESN2)elisa檢測試劑盒英文名稱：SESN2 ELISA Kit，SESN2，

Penguin蛋白(PEN)elisa檢測試劑盒英文名稱：PEN ELISA Kit，PEN，

Rhotekin2蛋白(RTKN2)elisa檢測試劑盒英文名稱：RTKN2 ELISA Kit，RTKN2，

N-去乙酰化mei/磺基轉移mei2(NDST2)elisa檢測試劑盒英文名稱：NDST2 ELISA Kit，NDST2，

Nesprin2蛋白(Nesp2)elisa檢測試劑盒英文名稱：Nesp2 ELISA Kit，Nesp2，

M2-型suan激mei(PKM2)elisa檢測試劑盒英文名稱：PKM2 ELISA Kit，PKM2，

Intersectin1蛋白(ITSN1)elisa檢測試劑盒英文名稱：ITSN1 ELISA Kit，ITSN1，

Genethonin1蛋白(GEN1)elisa檢測試劑盒英文名稱：GEN1 ELISA Kit，GEN1，

D-多巴色su變位mei(DDT)elisa檢測試劑盒英文名稱：DDT ELISA Kit，DDT，
Hoechst 33258染色液外消旋阿巴卡韋標準品規格:20mg 英文名稱：Abacavir Sulfate Racemic

雙-乙基乙氧ben酚jia氧ben基三嗪標準品規格:200mg 英文名稱：Bemotrizinol

七jia基三硅氧烷標準品規格:150mg 英文名稱：Heptamethyl Trisiloxane

鹽suan莫西沙星標準品規格:200mg 英文名稱：Moxifloxacin Hydrochloride

美索比妥標準品規格:500mg 英文名稱：Methohexital CIV

黃肉楠標準品規格:20mg 英文名稱：Actein

甘油山崳suan酯標準品規格:200mg 英文名稱：Glyceryl Behenate

沙丁anchun標準品規格:200mg 英文名稱：Albuterol

ben丙二chun標準品規格:100mg 英文名稱：Phenylpropanediol

癸氧喹酯標準品規格:200mg 英文名稱：Decoquinate
操作規程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)