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貨號(hào)	FS-X9542

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱：Caspase 4 活性檢測(cè)試劑盒

英文名稱：Caspase 4 Activity Assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20次|100次

貨號(hào)：FS-X9542

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒是采用分光光度法檢測(cè)細(xì)胞或組織裂解液中caspase 4酶活性或純化的caspase 4酶活性的試劑盒。本試劑盒用酶標(biāo)儀檢測(cè)或容量不超過100μl的分光光度檢測(cè)杯檢測(cè)時(shí)，除標(biāo)準(zhǔn)曲線外可以檢測(cè)20個(gè)樣品。

Caspase是一個(gè)在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 4有時(shí)被寫作caspase-4或caspase 4，可以和Apaf-1相互作用并參與細(xì)胞色素導(dǎo)致的caspase 3激活。Caspase 4也可以和caspase 14相互作用。

本Caspase 4活性檢測(cè)試劑盒是基于caspase 4可以催化底物Ac-LEVD-pNA(acetyl-Leu-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)產(chǎn)生黃色的pNA(p-nitroaniline)，從而可以通過測(cè)定吸光度來檢測(cè)caspase 4的活性。pNA在405nm附近有強(qiáng)吸收。

試劑盒中提供了caspase 4催化產(chǎn)生的黃色產(chǎn)物pNA，可以作為定量caspase 4酶活性的標(biāo)準(zhǔn)品。

試劑盒組分：

裂解液——————8ml

檢測(cè)緩沖液——————8ml

Ac-LEVD-pNA(2mM)———200μl

pNA(10mM)——————200μl

儲(chǔ)存條件：-20℃。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

肌球蛋白ⅦA(MYO7A)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：MYO7A ELISA Kit，MYO7A，

肌chun單磷suanmei3(IMPA3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：IMPA3 ELISA Kit，IMPA3，

紅細(xì)胞補(bǔ)體受體1(CR1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CR1 ELISA Kit，CR1，

核糖核suanmeiT2(RNASET2)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：RNASET2 ELISA Kit，RNASET2，

溶質(zhì)載體家族16成員3(SLC16A3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：SLC16A3 ELISA Kit，SLC16A3，

親核suα6(KPNα6)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：KPNα6 ELISA Kit，KPNα6，

醛固tong合mei(ALDOS)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ALDOS ELISA Kit，ALDOS，

前胰淀粉樣蛋白(ProIAPP)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ProIAPP ELISA Kit，ProIAPP，

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白12(GLUT12)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：GLUT12 ELISA Kit，GLUT12，

皮層肌動(dòng)蛋白(CTTN)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CTTN ELISA Kit，CTTN，

尿黑suan1,2-雙加氧mei(HGD)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：HGD ELISA Kit，HGD，

腦型脂肪suan結(jié)合蛋白(FABP7)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：FABP7 ELISA Kit，F(xiàn)ABP7，

膜聯(lián)蛋白A7(ANXA7)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ANXA7 ELISA Kit，ANXA7，

硫氧還蛋白還原mei3(TrxR3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：TrxR3 ELISA Kit，TrxR3，

磷脂meiB(PLB)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：PLB ELISA Kit，PLB，

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGER)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：AGER ELISA Kit，AGER，

突觸融合蛋白18(STX18)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：STX18 ELISA Kit，STX18，
Caspase 4 活性檢測(cè)試劑盒

雙-乙基乙氧ben酚jia氧ben基三嗪相關(guān)物質(zhì)混合物標(biāo)準(zhǔn)品

規(guī)格:100mg 英文名稱：Bemotrizinol Impurity Mixture

鹽suan貝那普利標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:125mg 英文名稱：Benazepril Hydrochloride

伏立康zuo相關(guān)物質(zhì)C 規(guī)格:10mg 英文名稱：

benjia地那an標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Denatonium Benzoate

環(huán)丙羧suan標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:150mg 英文名稱：Fluoroquinolonic Acid

鹽suan沙星標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:400mg 英文名稱：Ciprofloxacin Hydrochloride

fu康z(mì)uo標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Fluconazole

更昔韋相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:15mg 英文名稱：

乙ben妥英標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Ethotoin

ben琥an標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Phensuximide
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)