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| 貨號 | FS-X9558 |
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中文名稱：Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式檢測試劑盒
英文名稱：Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit
產(chǎn)品規(guī)格：50次
貨號：FS-X9558
產(chǎn)品介紹:
本試劑盒是一種采用Annexin-PE與7-AAD雙染法進行細胞早期凋亡分析的檢測試劑盒。 細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨(PS)從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就被破壞。7-AAD是一種核酸染料，可進入死細胞內(nèi)與DNA結(jié)合，能夠?qū)乃篮偷蛲鐾砥诘募毎M行染色。7-ADD與PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射波譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的佳替代品，因此通常將Annexin V-PE與ADD配合染色，以區(qū)別凋亡早期細胞與壞死細胞和凋亡的晚期細胞。 操作步驟： 1、細胞樣品的準備： a．對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。再次加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞。 b．對于懸浮細胞：1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的PBS，以避免吸走細胞。再次加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞。 2、用去離子水按1:3稀釋Binding Buffer(4ml Binding Buffer+12ml去離子水)。 3、用250μl Binding Buffer重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml。 4、取 100μl 的細胞懸液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V-PE 和 10μl 7-AAD 溶液。 5、混勻后于室溫避光孵育 15 分鐘。 6、在反應(yīng)管中加400μl PBS，流式細胞儀(FACS)分析。 Jurkat細胞用鉑誘導(dǎo)凋亡后用Annexin V-PE/7AAD雙染流式分析圖譜 儲存條件：2～8℃，避光保存 |
培養(yǎng)操作步驟：
1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；
2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；
3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；
4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；
5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學(xué)檢測。
實驗報告：
一、分離與培養(yǎng)： 1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小； 2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置； 3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化； 4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)； | 二、免疫熒光鑒定： 1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min； 2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min； 3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min； 4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜； 5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h； 6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。 |
操作規(guī)程
1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.
2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。
3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。
4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。
5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。
6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。
7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。
8、結(jié)果分析
a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100
b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)
細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2(SOCS2)檢測試劑盒 forSuppressorsOfCytokineSignaling2(SOCS2)
jia狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)檢測試劑盒 forThyroxineBindingGlobulin(TBG)
骨成型蛋白7(BMP7)檢測試劑盒 forBoneMorphogeneticProtein7(BMP7)
解整合su金屬蛋白mei12(ADAM12)檢測試劑盒 forADisintegrinAndMetalloprotease12(ADAM12)
磷suan泛酰半胱氨suan合成mei(PPCS)檢測試劑盒 forPhosphopantothenoylcysteineSynthetase(PPCS)
肌動絲蛋白(AF)檢測試劑盒 forActinfilin(AF)
蛋白激meiCβ1(PKCβ1)檢測試劑盒 forProteinKinaseCBeta1(PKCb1)
蛋白C(PROC)檢測試劑盒 forProteinC(PROC)
Smad同源物3(Smad3)檢測試劑盒 forMothersAgainstDecapentaplegicHomolog3(Smad3)
L1-細胞粘附分子(L1CAM)檢測試劑盒 forL1-CellAdhesionMolecule(L1CAM)
Toll樣受體7(TLR7)elisa檢測試劑盒 英文名稱：TLR7 ELISA Kit，TLR7，
ICOS配體(ICOSLG)elisa檢測試劑盒 英文名稱：ICOSLG ELISA Kit，ICOSLG，
P選擇su(P-Selectin/CD62P/GMP140)elisa檢測試劑盒 英文名稱：P-Selectin/CD62P/GMP140 ELISA Kit，P-Selectin/CD62P/GMP140，
CXC趨化因子受體3(CXCR3)elisa檢測試劑盒 英文名稱：CXCR3 ELISA Kit，CXCR3，
C4結(jié)合蛋白(C4BP)elisa檢測試劑盒 英文名稱：C4BP ELISA Kit，C4BP，
Ⅲ型前膠原C端肽(PⅢCP)elisa檢測試劑盒 英文名稱：PⅢCP ELISA Kit，PⅢCP，
4-羥基壬烯suan(HNE)elisa檢測試劑盒 英文名稱：HNE ELISA Kit，HNE，
Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式檢測試劑盒納他霉su標準品 規(guī)格:200mg 英文名稱：Natamycin
相關(guān)物質(zhì)A標準品 規(guī)格:100mg 英文名稱：Terfenadine Related Compound A
fu化鈉標準品 規(guī)格:1g 英文名稱：
非索非那定相關(guān)物質(zhì)A標準品 規(guī)格:25mg 英文名稱：
龍醋suan特丁酯標準品 規(guī)格:200mg 英文名稱：Prednisolone Tebutate
化鉀標準品 規(guī)格:1g 英文名稱：Potassium Iodide (AS)
碘海chun相關(guān)化合物B標準品 規(guī)格:50mg 英文名稱：
碘fuchun相關(guān)物質(zhì)A標準品 規(guī)格:50mg 英文名稱：
戊硫代巴比標準品 規(guī)格:250mg 英文名稱：Thiopental CIII
戊巴比標準品 規(guī)格:200mg 英文名稱：Pentobarbital CII
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