【儀表網 研發快訊】結構光照明顯微鏡(SIM)以成像速度快、無需特殊熒光標記和光毒性小等優勢，被視為當前最適合活細胞成像的超分辨(SR)技術。經過二十多年的快速發展，SIM在成像理論和應用研究方面都取得了長足進步，但依然有許多普遍存在的棘手問題亟待解決和完善。
 

　　中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所李輝團隊著眼于解決SIM在實際生物成像應用中的短板，致力于打造“user acknowledgeable”的SIM成像技術和儀器裝備，最近在避免結構光參數估計、深度學習圖像重構、升級寬場顯微鏡系統的模塊化SIM解決方案等方面取得系列重要進展。
 

　　長期以來，大多數SIM算法直接或間接遵循標準的Wiener-SIM架構或依賴于其重建結果。Wiener-SIM重建涉及耗時的照明條紋參數估計和偽影敏感的頻域去卷積。此前，李輝團隊發展了基于“頻譜優化”理念的高保真SIM重建技術HiFi-SIM并發表于Light: Science & Applications, 10, 70, (2021)，有效克服了SIM圖像中的典型偽影，但HiFi-SIM仍依賴于結構光條紋參數的精確估計。然而，條紋參數很小的偏差就會導致Wiener-based SIM算法產生明顯偽影，實踐中現有的參數估計方法在很多成像場景中經常難以估計出可靠的條紋參數。更關鍵地，Wiener-SIM重建假設條紋參數在成像視場內均勻分布，但采集圖像的條紋參數不僅依賴于條紋質量還受樣本特性影響，因此難以保證全視場中的均一性。
 

　　針對上述問題，李輝團隊的文剛等開發了一種無需估計結構光條紋參數的直接重建SIM算法，direct-SIM (direct reconstruction SIM algorithm)。該方法采用空域直接重建與頻域頻譜優化相結合的聯合重建策略，避免了耗時且麻煩的條紋參數估計，同時采用新型頻譜優化策略繞過了偽影敏感的頻域Wiener濾波去卷積(圖1a)。得益于其局域獨立重建的特性，direct-SIM對于包含多組不同條紋的場景依然能夠重建高質量SR圖像(圖1b)。該研究成果以“Spectrum-optimized direct image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy”為題發表于PhotoniX 期刊(中科院1區Top，IF16.5)，其中，文剛副研究員為第一作者，唐玉國研究員和李輝研究員為通信作者。
 

　　相比于上述基于物理模型的SIM算法，深度學習近年來被廣泛用于SIM超分辨圖像重建來減少樣本光漂白和光毒性。然而，數據驅動的深度學習算法用于預測未經訓練的生物結構的可靠性仍飽受質疑。當前，基于深度學習的SIM算法需要對不同生物樣本單獨訓練以達到理想的預測性能，但仍難以可靠地應用于未訓練結構的觀察。
 

　　為此，李輝團隊進一步發展了一種基于關鍵幀輔助的動態SIM成像方程，命名為KFA-RET：在動態成像過程中，第1幀SR圖像由成像初始采集的完整原始圖像通過傳統SIM重建算法重建，該高保真SR圖像被作為關鍵幀參與后續重建；隨后通過基于深度學習的重構算法KFA-RET實現寬場圖像的SR重建。KFA-RET以關鍵幀結構作為參照并結合生物結構的時間連續性，極大地提高了重建SR圖像的質量，同時有效地減少了光漂白和光毒性。此外，KFA-RET對網絡未訓練過的新生物樣本結構也具有很強的遷移能力。該研究成果以“Keyframe-aided resolution enhancement network for dynamic super-resolution structured illumination microscopy”為題發表于Optics Letters，其中博士研究生唐于珺為論文第一作者，李輝研究員為通信作者。
 

　　為了適應更多不同用戶對SIM成像儀器配置的要求，李輝團隊在之前開發安裝于顯微側邊的結構光照明插件(HiFi-SIM-C)的基礎上，進一步開發了安裝于顯微鏡后口的結構光照明模塊HiFi-SIM-B。可安裝于多款國產和進口的倒置熒光顯微鏡，并且與常規的寬場熒光照明器兼容，具有體積小、穩定性高、安裝方便等優點，為實驗室原有熒光顯微鏡進行高性價比的超分辨升級改造提供了更多選擇。目前，搭載在國產舜宇IRX60倒置熒光顯微鏡的HiFi-SIM-B樣機在2023年細胞生物學大會展，獲得廣泛關注。搭載在奧林帕斯IX73手動倒置熒光顯微鏡的HiFi-SIM-B樣機也于近期交付中國科學技術大學生命科學院使用。
 

　　圖3 (a)兼容熒光照明器的顯微鏡后口結構光照明模塊HiFi-SIM-B; (b)搭載在國產舜宇顯微鏡的HiFi-SIM-B在2023年中國細胞生物學第十八次學術大會(蘇州)上展出; (c)搭載在奧林巴斯IX73顯微鏡上的HiFi-SIM-B在中國科學技術大學裝機現場及成像效果圖。