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【產(chǎn)品名稱】RNA恒溫快速擴增試劑盒（試紙條型）-III【包裝規(guī)格】
貨號：WLRN8211KIT
規(guī)格：48份/盒
【原理概述】
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術：在常溫恒溫下（一般為39 oC~42 oC），反轉錄酶利用特異性引物和模板RNA合成cDNA鏈，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白的幫助下，重組酶和引物形成復合體；進行同源搜索并結合目的同源域，此時在該同源位置形成D-loop區(qū)并開始進行鏈交換；伴隨著重組酶從復合體上解離，聚合酶也結合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。依賴核酸酶的作用，加入根據(jù)模板設計的特異的分子探針，使用膠體金技術（三明治夾心法）可以對最終結果進行檢測。
【產(chǎn)品特點】
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時間短（僅需15 min）等優(yōu)點，反應組分為干粉狀態(tài)，操作簡便，易于保存。
本試劑對設備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進行反應操作，無需購買PCR擴增儀等價格高昂的專屬設備。
【引物設計】
建議使用長度在30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標記一個修飾基團（常用）。引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長度建議在150-500 bp。
【熒光探針設計】
在上下游引物中間，設計一段長度為46-52nt
與目的片段互補的序列；5’端修飾一個抗原標記（典型FAM）；在5’端和3’末端的中部位置標記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸酶的識別位點；3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer等。
【試劑盒組成】
組成 含量
A buffer 1.6 mL×1管
B buffer 150 μL×1管
試劑 48份
使用說明書 1份
注：考慮到核酸降解問題，RNA系列產(chǎn)品暫未提供正對照模板和引物探針。
【試劑盒儲存】
1．儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 °C恒溫環(huán)境，避光保存，避免重壓；
2．產(chǎn)品有效期：14個月；
3．生產(chǎn)日期見外包裝。
【操作步驟】
提前將試劑盒液體組分取出，室溫融化，震蕩混勻。
(1)每個干粉反應管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需融化混勻，否則會對實驗效果產(chǎn)生影響）；
(2)每個反應管分別加入2 μL上游引物、 2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應管中）；
(3)向反應管中依次加入5 μL 核酸模板和8.5 μL ddH2O （也可根據(jù)實際需求調(diào)整加入模板的體積，并相應調(diào)整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為13.5 μL）；
(4)最后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（注意：a. B buffer是啟動反應的緩沖液，一旦進入體系意味著酶被激活；b. 請務必以上下顛倒甩動反應管8-10次的方式進行混勻，渦旋、彈管子等方式可能無法有效混勻；c. 對于多個反應，建議將B buffer加至反應管的蓋子內(nèi)側，蓋好后上下顛倒后混勻，可保證反應同時啟動）；
(5)混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入恒溫設備中40-42 oC孵育15min~20min；
(6)反應結束后，用ddH2O將擴增產(chǎn)物稀釋10～20倍，混合均勻后，進行試紙條顯色，5 min內(nèi)觀察質控線與檢測線判讀結果。
體系配制
組分 體積（μL）
A buffer 29.4
上游引物(10 μM) 2
下游引物(10 μM) 2
探針(10 μM) 0.6
ddH2O和核酸模板 13.5
B buffer 2.5
總體積 50
【注意事項】
1.使用前請仔細閱讀說明書，嚴格按照操作步驟進行操作；
2.樣品處理應該嚴格按照生物安全規(guī)范操作，在進行反應時請注意避免核酸污染，并設置空白對照；
3.使用時請取出實驗所需的MIRA反應單元的數(shù)量，剩余部分請置于存儲條件下；
4.使用有效期內(nèi)試劑，且各組分不得與其他批號的相應成分混用。
