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細(xì)胞培養(yǎng)的具體操作步驟與注意事項(xiàng)!

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細(xì)胞培養(yǎng)的具體操作步驟與注意事項(xiàng)!


一、細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟


⒈細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后,在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移入15ml離心管中,加入10ml預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹勻,離心,2000rpmX2min,棄上清液。加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入10ml DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打,接種于10cm盤中,在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。


⒉細(xì)胞傳代

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí).去培養(yǎng)基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM*培養(yǎng)基終止消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。再加入10ml PBS(經(jīng)高壓滅菌,保存于40C),吹勻,吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù),按照1×105/盤接種,在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。


⒊細(xì)胞凍存

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí),去培養(yǎng)基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。加入1ml凍存液(90%血清,10%DMSO),放入凍存盒內(nèi)(盒內(nèi)有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入一80℃冰箱內(nèi),過(guò)夜,第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放入液氮,可以保存三個(gè)月。

凍存液的配制:70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,邊滴邊搖。


二、細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)


⒈次開始培養(yǎng)某種細(xì)胞時(shí),一定要在用該細(xì)胞的名稱進(jìn)行檢索,可以得到關(guān)于該細(xì)胞的詳細(xì)信息,包括需要使用的培養(yǎng)基、血清、添加劑、通常的消化時(shí)間、傳代時(shí)間等。對(duì)于特定的細(xì)胞(如原代培養(yǎng)的細(xì)胞),需要查閱相關(guān)文獻(xiàn)來(lái)獲得更準(zhǔn)確的培養(yǎng)方法。


⒉進(jìn)入細(xì)胞間開始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),必須嚴(yán)格按照下列步驟操作:

①確定所有的細(xì)胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測(cè)沒(méi)有問(wèn)題,不確定的溶液和耗材請(qǐng)勿使用,除非特殊情況,不要借用別人的溶液。

②確定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。

③確定酒精燈內(nèi)的酒精量,需要的話及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋,實(shí)驗(yàn)開始前可以把所有瓶蓋旋松。

⑤盡量不要直接傾倒溶液,除非瓶口沒(méi)有被燒壞。如果傾倒失敗,溶液粘在瓶口,請(qǐng)用噴過(guò)75%酒精的紙巾仔細(xì)清潔瓶口周圍(不要接觸到瓶口)后在火焰上簡(jiǎn)單燒灼。

⑥操作時(shí)如果不能肯定所用的耗材是潔凈的,必須及時(shí)更換。

⑦實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾,保持工作區(qū)域清潔整齊,后用75%酒精清潔臺(tái)面。


⒊細(xì)胞污染的預(yù)防

①實(shí)驗(yàn)用品防止污染。細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要*,各種溶液滅菌要仔細(xì),并在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)陰性后才能使用。操作室及剩余的無(wú)菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。

②操作過(guò)程防止污染。

③穿著容易起靜電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂后才能進(jìn)入細(xì)胞間。

④實(shí)驗(yàn)開始前需要確定戴的手套沒(méi)有問(wèn)題,只要接觸過(guò)生物安全柜之外的物品,必須及時(shí)對(duì)手套進(jìn)行消毒。

⑤進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)間后關(guān)好門,坐下來(lái)盡量少走動(dòng)以免影響生物安全柜的風(fēng)簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴(yán)格檢查所用的器材、溶液和細(xì)胞,不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無(wú)菌室內(nèi),更不能隨便使用,以免造成大規(guī)模污染。

⑥細(xì)胞操作時(shí)動(dòng)作要輕,必須在火焰周圍無(wú)菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,并將瓶口放在火焰周圍簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼,注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。

⑦實(shí)驗(yàn)操作時(shí)生物安全柜的隔板要盡可能放低,盡量減少談話,打噴嚏或咳嗽時(shí)不能對(duì)著工作區(qū),以免造成不必要的污染。

⑧瓶蓋應(yīng)當(dāng)?shù)狗旁谶h(yuǎn)離自己的地方,以避免瓶蓋被誤操作所污染。

⑨不要從敞開的容器口上方經(jīng)過(guò),以避免衣服上掉落不明物體對(duì)細(xì)胞的污染。

⑩實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要注意及時(shí)更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管,切勿一根管子做到底。一旦發(fā)現(xiàn)接觸了非潔凈或者無(wú)法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)收拾,保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊,后用75%酒精清潔臺(tái)面。


⒋防止細(xì)胞交叉污染

①在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí),所用器具要嚴(yán)格區(qū)分,好作上標(biāo)記便于辨別。按順序進(jìn)行操作,一次只處理一種細(xì)胞,多種細(xì)胞多種操作一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生t昆亂。

②在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí),粘有細(xì)胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口,以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)基中污染其他細(xì)胞。

③所有細(xì)胞一旦購(gòu)置,或從別處引入,或自己建立,必須及時(shí)保種凍存,一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)。


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