色譜柱的使用前后都需經較強的流動相沖洗。通常情況下，在使用硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱時，每次用完后可先用二氯甲烷或正己烷等溶劑低流速長時間的沖洗；鍵合反相硅膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱可先用高比例的水（甲醇水混合溶劑）沖洗，再用99%甲醇沖洗。此外，色譜柱低流速的反相沖洗能夠有效除去堵塞在柱頭或篩板上的雜質，以及清洗聚集在柱頭部位的較強吸附物質。有些色譜柱在許多方法處理污染失效后，反過來使用，不僅柱壓降變小，柱效也可恢復如，延長了色譜柱的使用時間。
若上述常規清洗法無法清除污染物，則有必要采用更強的洗脫劑清洗，如反相材料的沖洗順序為：99%甲醇→99%乙腈→乙腈∶異丙醇(75∶25，V/V)→99%異丙醇。或者可以采用較低濃度的稀酸或稀堿可將有機溶劑不能洗脫的污染物除去。例如采用0.05mol/L的硫酸和流動相溶液沖洗色譜柱，可取得良好效果；或者采用1%氫氧化銨或50%二甲基甲酰胺水溶液，對聚集在柱頭的污染物具有良好的清洗效果。
如果分析時流動相中含有緩沖液（通常為鹽溶液），沖洗時宜用水取代緩沖液與有機相混合沖洗色譜柱（20倍柱體積）；再用99%有機溶劑沖洗。若直接用99%有機溶劑沖洗，可造成緩沖液沉積析出，從而損壞柱子品質。同樣的，若流動相中加入酸、堿溶液時，也應當按照上述方法，先采用高比例的水（水：甲醇10:90）沖洗20倍柱體積，防止強酸強堿溶液導致硅膠基質填料的溶解。
蛋白質對反相色譜柱的污染已成為常見問題，尤其在分離未經處理的動物組織等生物樣品。一般情況下，純有機溶劑如乙腈或甲醇不能很有效地清洗色譜柱，因而需要一些特殊的清洗方法。首先嘗試用高比例強極性溶劑的流動相進行沖洗，如乙腈∶異丙醇（1:2,V/V）；或使用0.1%的三水溶液或者0.1%乙酸水溶液清洗。此外，還可以采用1%十二烷基硫酸鈉 (SDS)，然后用5%～95%乙腈/水（含0.1%TFA）梯度沖洗，去除蛋白污染物效果也較好。
若采用上述的條件清洗后色譜柱仍不能達到理想的效果，有必要將固定相從色譜柱內取出，進行清洗再生后重新裝填。具體操作是：將色譜固定相從色譜柱內打出后，用甲醇浮選，去除其中細小的破碎顆粒；然后用二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇超聲清洗；最后干燥固定相，重新裝填色譜柱。經該方法處理的色譜柱，性能可得到顯著提高。
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