本文介紹了對培養貼壁細胞系進行傳代的一般工作流程及步驟說明。哺乳類細胞體外培養是在癌癥、藥物開發、組織工程、干細胞、疾病細胞和分子生物學等生物醫學研究領域進行臨床和藥物研究的重要模型。要想成功維持細胞系，需要通過控制生長條件來維持細胞生理和表型的穩定性。定期監測細胞生長，對細胞進行傳代培養以確保連續性。

哺乳類細胞培養對臨床和藥物研究與應用至關重要，其可用于構建靈活的健康和疾病模型系統。例如在機能研究可支持電腦模擬分析并可用于替代動物模型。

細胞增殖取決于細胞類型（從動物組織分離的原代細胞、胚胎干細胞、自我更新細胞、穩定永生化細胞系、轉化細胞）和培養條件（培養基、2D/3D細胞外基質、溫度、PH值、CO2/O2濃度）。在培養條件下可以培養出用于各種實驗分析的細胞。隨著動物細胞培養技術的進步，細胞系逐步演變并被用于疫苗生產、治療性蛋白、藥物制劑和抗癌制劑。

要想成功維持哺乳類細胞系，必須在受控條件下培養細胞并使用特定培養基。此外，為保證細胞生理和表型的穩定性，必須定期監測細胞生長狀況。通常情況下，當細胞匯合度達到80%左右，須對細胞進行傳代培養，以確保細胞生長良好且健康。細胞匯合度達80%指的是培養皿80%的表面被細胞所覆蓋。注意：傳代培養細胞的匯合度取決于細胞類型且可能還需優化。

步驟1

從培養箱中取出細胞并放在顯微鏡下快速檢查。應每天進行顯微鏡檢查，確保細胞處于健康狀態（無污染、死亡細胞少）并按預計生長。

在培養貼壁細胞時，細胞應主要附著在培養皿活燒瓶底部，培養基應呈粉橙色。由于培養基中細胞代謝物（或污染）導致酸化，因此酸堿指示劑酚紅呈黃色。由于培養基中細胞代謝物（或污染）導致酸化，因此酸堿指示劑酚紅呈黃色。在正常明場照明下難以觀察到這些細胞。切換至相差可以使細胞更容易被觀察到。如圖所示，使用DMi1，只需移動聚光鏡環的滑塊即可選擇相差。

記錄細胞狀態對確保各實驗結果一致十分重要。DMi1可配備攝像頭和屏幕，通過遠程控制輕松實現成像和保存。研究人員使用Mateo TL集成攝像頭可以拍攝細胞圖像，追蹤培養基狀況，將圖像轉存智能設備或U盤。

比較狗腎臟細胞在明場照明和相差圖像中的顯示效果：相差圖像的概覽效果更好，更易于檢查細胞形態和細胞計數。

步驟2

用移液器將培養基吸取至廢物容器中。也可以使用接有真空吸液器的移液器。

使用5ml不含鈣鎂的預熱PBS緩沖液仔細沖洗細胞，沖洗3次，去除殘留培養基中的胎牛血清。胎牛血清及其替代物會抑制。加入3ml預熱/乙二胺四乙酸，輕輕轉動培養皿使其均勻覆蓋培養皿底部的細胞。在37°C下培育幾分鐘即可傳代細胞。

 不同細胞系需要的培養時間不同。為避免過度化使細胞受損，每隔幾分鐘在顯微鏡下檢查一次細胞。

輕柔地沖洗培養皿，并將細胞懸浮液轉移至50ml試管中，以800rpm的速度轉動5分鐘使細胞沉降下來。吸走上層清液并在10ml新鮮培養基中重懸細胞，去除。

分離出的細胞應呈圓形并在溶液中自由漂浮。細胞一經分離，即向培養皿中加入5ml培養基，滅活。

步驟3

將100µL細胞懸浮液與等量的0.4%臺盼藍溶液混合。臺盼藍選擇性滲入死亡細胞的細胞膜并將其染藍，但不會被活細胞吸收。將蓋玻片置于計數表面上，準備好血球計。

將移液器吸嘴置于蓋玻片邊緣輕輕擠出細胞懸浮液，將其滴加在計數室上（單位面積約4µl）。蓋玻片下的整片區域發生毛細管作用。大多數情況下，計數室有兩個計數區可各自承接液體。

將計數室放在顯微鏡載物臺上并將焦點集中在細胞上。方形計數網格樣式依計數室類型而定。圖中所示的Fuchs-Rosenthal有16個區域，每個區域1平方毫米，整體被線包圍。每個正方形區域被細分為16個小正方形。如圖所示，計算一個區域內16個正方形中的細胞總數。為避免重復計算位于大正方形邊線上的細胞，僅計算位于正方形兩條邊上的細胞。在本例中，觸及正方形上方和左側標紅邊線（加粗紅線）的細胞應被計入。觸及下方和右側紅色邊線的細胞應不被計入。計算計數室5個1平方毫米區域內的活細胞和死亡細胞。要計算最終結果，需要合計5個正方形的計數結果。為求得更精確的測算結果，也可以計算計數室其他正方形（大于5個）的細胞數量。

使用以下公式可計算細胞濃度：

此外還可使用細胞自動計數器。

步驟4

用移液器將所需細胞量（合適的細胞數量）以所需分離率（此處為1:10）吸取至新的培養皿中，在各培養皿中加入所需容積的培養基（10ml）。注意細胞類型、細胞分離日期以及培養皿蓋子上的細胞傳代次數。將細胞放回37°C培養箱中。

將細胞放置一晚，讓其恢復和沉降。24小時后使用顯微鏡檢查細胞形狀、黏著性及是否存在污染。

細胞應附著在培養皿底部并已開始生長和分裂。細胞應附著在培養皿底部并已開始生長和分裂。讓細胞生長直至匯合并準備好進入實驗或開始下一輪傳代培養。

參考文獻：

1.W. Ockenga, Phase Contrast: Making Unstained Phase Objects Visible, Science Lab (2011) Leica Microsystems.