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iPSC單克隆案例分享丨MG基質膠、CEPT提高iPSC單克隆效率

來源:廣州市艾貝泰生物科技有限公司   2023年05月23日 10:37  

誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)是指通過人工對體細胞進行重編程,逆分化培養出的一類具有類似人胚干細胞特征的多能干細胞。它們具有體外培養無限增殖、自我更新的能力以及巨大的分化潛能,在藥物發現、合成生物學和細胞治療等方面具有巨大的前景。隨著iPSC應用的增多,勢必有越來越多的需求去建立標準化的單克隆iPSC主細胞庫(MCB),用于后續的可持續供應且穩定的生產工藝流程中。

材料與方法
Cytena單細胞打印機通過噴墨式打印技術,溫和的將單個細胞自動分離到標準的96或384孔板中,分選過程中,高分辨率的光學系統可根據細胞直徑、圓度或熒光強度分選出需要的單細胞,且提供單細胞來源的圖像證據,有助于通過監管機構的審核。

為了提高單細胞分選效率,比較不同重懸體系對分選過程的影響;為了提高克隆效率,對不同基質膠對克隆效率的影響進行了比較;比較了用Y-27632或CEPT處理后的克隆效率;通過核型分析,判斷CEPT的處理是否會引起遺傳異常。

01 CEPT四組分混合物的確定
通過超低細胞密度的高通量篩選確定四因子混合物CEPT:Chroman 1 (ROCK 抑制劑), Emricasan (半胱天冬酶抑制劑),Polyamines(多胺)和Trans-ISRIB(綜合應激反應抑制劑)。其用于改善細胞存活、細胞附著和蛋白質翻譯。

02樣品準備
iPSC細胞:細胞培養4/5天時,達到60%匯合度,使用TrypLE select消化細胞,使用 20-40 μm 過濾器(清除懸浮液中可能阻礙芯片的團塊),最后重懸于HBSS/E8 medium/DMEM/StemFlex+ Rock抑制劑中,濃度為0.5x106  cells/mL。

03單細胞分選

使用Cytena單細胞打印機可直接捕獲噴嘴圖像作為嚴格單細胞分選證據。流式分選作為對照組。


04克隆增殖

選擇八個利用CEPT產生的克隆并建立克隆細胞系。


05核型分析

四次傳代后,對八個選擇的克隆細胞系進行核型分析


結果
使用mTeSR/E8 + Rock抑制劑分別對樣品進行重懸,濃度為0.5x 10cells/mL進行上機分選都有不錯的表現。在同一iPSC細胞中,對比了LN521和LN521+E-Cad的差異,發現E-cad的存在對單克隆率沒有提升效果,單克隆率反而降低。MG基質膠能很顯著的提升iPSC細胞單克隆率,在LN521基質膠中,單克隆不到1%,但是MG基質膠中卻有38%的單克隆率。在第三個iPSC細胞中,用添加了RevitaCell的mTeSR1重懸細胞,然后分選單細胞在MG基質膠的孔板中,獲得了68%的單克隆率。

圖1:使用不同重懸培養基以及不同基質膠處理后的單克隆率表(MG: Matrigel; LN521: Laminin 521; E-Cad: E-Cadherin)

Cytena 單細胞打印機分選過程中能留下多張噴嘴圖片,在噴嘴的ROI檢測識別區域,軟件能識別細胞的直徑、圓度等參數,確認細胞的“良好狀態”,符合要求的“強壯的”單細胞到孔板里,不符合要求的細胞則被真空吸走。噴嘴圖片證實單細胞來源,單細胞鋪板效率>95%。

圖片2.png

圖2:單細胞率[1]

Yu Chen[2]等發現,相比于Y-2762,CEPT能顯著提升iPSC的單細胞過程中的存活率,相同小分子處理下,用Cytena單細胞打印機分選iPSC細胞,一塊96孔板獲得68個iPSC單克隆孔,比流式細胞儀分選高出~20%。

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隨機選擇八個利用CEPT產生的克隆建立克隆細胞系,四次傳代后,所有克隆細胞系(8/8)均為核型正常,表明CEPT不會引起遺傳異常。

圖片5.png

圖5:CEPT未引起遺傳異常

圖6:Cytena 單細胞打印機用于iPSC基因修飾后的CLD


討論
iPSC對培養環境的變化十分敏感,如pH值、滲透壓、營養供應、機械應力/剪切力等。在傳統的培養條件下,iPSC通常在涂有各種細胞外基質表面上密集生長。在對iPSC基因組編輯過程中,挑戰之一是獲得陽性單克隆細胞。單個iPSC的生長過程中,減少了細胞和細胞之間、細胞與細胞外基質的接觸,容易誘發細胞失巢凋亡,導致單細胞存活率顯著下降。一方面,抑制細胞失巢凋亡的產生,會改善單細胞存活率;另一方面,溫和的自動化分選系統可以進一步優化陽性單克隆細胞的篩選平臺。

在此研究中,使用Cytena 單細胞打印機展示了一個具有代表性的高效分選iPSC的工作流程。分選過程中通過捕捉噴嘴圖片證實單細胞來源,單細胞鋪板效率>95%(圖2);一塊96孔板獲得68個單克隆孔(圖3);使用mTeSR/E8進行重懸,在基質膠的選擇中,使用MG可以顯著提高iPSC單細胞恢復率;四組分CEPT處理后的iPSC克隆有效率更高(圖4),且不會引起遺傳異常。

Cytena單細胞打印機的高效的微流控細胞分選,搭配小分子混合物CEPT的工作流程,一方面提升了iPSC的單克隆效率,同時單克隆又保持了原有的形態學特點,這一工作流程將突破現有的技術瓶頸成為新的標準流程,能滿足后續的單克隆iPSC主細胞庫(MCB)的建立需求,用于日后的可持續供應和穩定的生產流程。

參考文獻:
1.Vallone et al. Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub-Cloning of Human Pluripotent Stem Cells, Current Protocols in Stem Cell Biology e123, Volume 55(2020).
2.Chen Y , Carlos A. T ,  Chen L,et al. A Versatile Polypharmacology Platform Promotes Cytoprotection and Viability of Human Pluripotent and Differentiated Cells. Nat Methods. 18(5), 528–541(2021).

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