葡萄是一種營養豐富、美味可口的水果，深受世界各地消費者的喜愛。近年來，無籽葡萄也越來越受大家的歡迎，因此，無籽葡萄品種的培育成為一個重要的育種目標，而了解葡萄種子發育的分子遺傳調控機制對于無籽栽培品種的培育至關重要。

2023年4月13日，西北農林科技大學王西平課題組的新研究成果，發表在Horticulture Research期刊上(影響因子7.291)，文章題目為“Control of ovule development in Vitis vinifera by VvMADS28 and interacting genes”。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術鑒定了葡萄中一個MADS-box轉錄因子的結合基序及其靶基因，揭示了VvMADS28參與葡萄胚珠和種子發育的調控機制，為培育無籽葡萄新品種奠定了理論基礎。

MADS-box基因編碼高等植物中的一大類轉錄因子，并在植物發育過程中發揮各種作用，包括花、果實和種子發育。MADS結構域蛋白通常以同型二聚體或異型二聚體的形式相互作用，從而擴展了功能多樣性。在葡萄中，已經發現了幾個參與種子形成的MADS-box基因（VviAGL11、VvAG2、VvSEP3、VvMADS39、VvMADS45）。該課題組在之前發表的工作中揭示了VvMADS45在葡萄種子發育中的作用，以及VvMADS39在花和胚珠發育中作用。本研究主要對MADS-box家族的VvMADS28進行進一步的功能驗證及其分子調控機制的探究。

圖1. VvMADS28的表達模式分析及亞細胞定位

本研究首先對葡萄中VvMADS28的時空表達模式進行研究。RT-qPCR檢測發現，VvMADS28在有籽葡萄“紅地球”和無籽葡萄“湯普森無核”的多種組織中普遍都有表達。其中，表達較強烈的組織是花序、花、果實，表達最弱的是根和葉。在胚珠發育過程中，VvMADS28在“紅地球”30 DAF（開花后天數）表達量最 高，此后在“紅地球”中的表達一直強于“湯普森無核”，而且“紅地球”中VvMADS28基因的較強表達模式與種子發育相一致。此外，原位雜交實驗發現，在2個品種的15 DAF胚珠中均能檢測到VvMADS28的mRNA表達。“紅地球”中在30 DAF和35 DAF時均有相對較強的表達。相比之下，“湯普森無籽”胚珠在25 DAF后幾乎沒有表達。該結果與RT-qPCR結果相似。以上這些結果表明，VvMADS28在珠被的形成中起重要作用。基因功能不僅由基因的時空表達模式決定，還與該基因產物的亞細胞定位有關。在擬南芥原生質體中表達攜帶GFP標簽的VvMADS28，檢測到熒光信號定位于細胞核，這表明VvMADS28是一個轉錄調控因子。

通過ChIP-qPCR發現，在“湯普森無核”胚珠中VvMADS28的抑制與H3K27me3有關。在轉基因番茄中VvMADS28的過表達，導致萼片增大、果實變小、種子數量減少，而種子大小沒有顯著的變化。與對照組相比，利用“紅地球”構建的VvMADS28-RNAi株系表現為種子質量減少、果實和種子體積縮小、種子皺縮且排列不規格、種皮細胞排列松散。這些結果說明VvMADS28在維持正常的種子發育中起重要作用。
采用酵母單雜交（Y1H）技術鑒定到VvMADS28上游的一個調控基因VvERF98，該基因編碼一個乙烯反應因子，它在2個葡萄品種中的表達模式與VvMADS28相似。此外，雙熒光素酶報告實驗、VvERF98-GUS 過表達實驗進一步證明了VvERF98可以正調控VvMADS28的表達。隨后，將種子用10 mM乙烯利處理，發現VvERF98和VvMADS28的表達水平均顯著升高。這說明在種子發育過程中VvERF98是VvMADS28上游的一個轉錄調控因子，且可以響應乙烯信號。

圖2. DAP-seq分析葡萄VvMADS28的結合基序及其潛在靶基因

圖3. VvMADS28調控種子發育的分子機制網絡模型