葡萄是一種營養(yǎng)豐富、美味可口的水果，深受世界各地消費(fèi)者的喜愛。近年來，無籽葡萄也越來越受大家的歡迎，因此，無籽葡萄品種的培育成為一個(gè)重要的育種目標(biāo)，而了解葡萄種子發(fā)育的分子遺傳調(diào)控機(jī)制對(duì)于無籽栽培品種的培育至關(guān)重要。

2023年4月13日，西北農(nóng)林科技大學(xué)王西平課題組的新研究成果，發(fā)表在Horticulture Research期刊上(影響因子7.291)，文章題目為“Control of ovule development in Vitis vinifera by VvMADS28 and interacting genes”。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了葡萄中一個(gè)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序及其靶基因，揭示了VvMADS28參與葡萄胚珠和種子發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，為培育無籽葡萄新品種奠定了理論基礎(chǔ)。

MADS-box基因編碼高等植物中的一大類轉(zhuǎn)錄因子，并在植物發(fā)育過程中發(fā)揮各種作用，包括花、果實(shí)和種子發(fā)育。MADS結(jié)構(gòu)域蛋白通常以同型二聚體或異型二聚體的形式相互作用，從而擴(kuò)展了功能多樣性。在葡萄中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)參與種子形成的MADS-box基因（VviAGL11、VvAG2、VvSEP3、VvMADS39、VvMADS45）。該課題組在之前發(fā)表的工作中揭示了VvMADS45在葡萄種子發(fā)育中的作用，以及VvMADS39在花和胚珠發(fā)育中作用。本研究主要對(duì)MADS-box家族的VvMADS28進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證及其分子調(diào)控機(jī)制的探究。

圖1. VvMADS28的表達(dá)模式分析及亞細(xì)胞定位

本研究首先對(duì)葡萄中VvMADS28的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行研究。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，VvMADS28在有籽葡萄“紅地球”和無籽葡萄“湯普森無核”的多種組織中普遍都有表達(dá)。其中，表達(dá)較強(qiáng)烈的組織是花序、花、果實(shí)，表達(dá)最弱的是根和葉。在胚珠發(fā)育過程中，VvMADS28在“紅地球”30 DAF（開花后天數(shù)）表達(dá)量最 高，此后在“紅地球”中的表達(dá)一直強(qiáng)于“湯普森無核”，而且“紅地球”中VvMADS28基因的較強(qiáng)表達(dá)模式與種子發(fā)育相一致。此外，原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在2個(gè)品種的15 DAF胚珠中均能檢測到VvMADS28的mRNA表達(dá)。“紅地球”中在30 DAF和35 DAF時(shí)均有相對(duì)較強(qiáng)的表達(dá)。相比之下，“湯普森無籽”胚珠在25 DAF后幾乎沒有表達(dá)。該結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果相似。以上這些結(jié)果表明，VvMADS28在珠被的形成中起重要作用。基因功能不僅由基因的時(shí)空表達(dá)模式?jīng)Q定，還與該基因產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位有關(guān)。在擬南芥原生質(zhì)體中表達(dá)攜帶GFP標(biāo)簽的VvMADS28，檢測到熒光信號(hào)定位于細(xì)胞核，這表明VvMADS28是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

通過ChIP-qPCR發(fā)現(xiàn)，在“湯普森無核”胚珠中VvMADS28的抑制與H3K27me3有關(guān)。在轉(zhuǎn)基因番茄中VvMADS28的過表達(dá)，導(dǎo)致萼片增大、果實(shí)變小、種子數(shù)量減少，而種子大小沒有顯著的變化。與對(duì)照組相比，利用“紅地球”構(gòu)建的VvMADS28-RNAi株系表現(xiàn)為種子質(zhì)量減少、果實(shí)和種子體積縮小、種子皺縮且排列不規(guī)格、種皮細(xì)胞排列松散。這些結(jié)果說明VvMADS28在維持正常的種子發(fā)育中起重要作用。
采用酵母單雜交（Y1H）技術(shù)鑒定到VvMADS28上游的一個(gè)調(diào)控基因VvERF98，該基因編碼一個(gè)乙烯反應(yīng)因子，它在2個(gè)葡萄品種中的表達(dá)模式與VvMADS28相似。此外，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、VvERF98-GUS 過表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了VvERF98可以正調(diào)控VvMADS28的表達(dá)。隨后，將種子用10 mM乙烯利處理，發(fā)現(xiàn)VvERF98和VvMADS28的表達(dá)水平均顯著升高。這說明在種子發(fā)育過程中VvERF98是VvMADS28上游的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，且可以響應(yīng)乙烯信號(hào)。

圖2. DAP-seq分析葡萄VvMADS28的結(jié)合基序及其潛在靶基因

圖3. VvMADS28調(diào)控種子發(fā)育的分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)模型