1. 背景介紹

近年來，質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QBD）和過程分析技術(shù)（PAT）的概念被廣泛接受并應(yīng)用于評(píng)估過程的穩(wěn)健性，監(jiān)控和改進(jìn)過程開發(fā)和藥品生產(chǎn)。PAT技術(shù)，特別是在線和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)，在開發(fā)可靠的新工藝以生產(chǎn)具有期望質(zhì)量特性的產(chǎn)品方面顯示出巨大的潛力。它還可以通過實(shí)現(xiàn)方便、實(shí)質(zhì)和連續(xù)的測(cè)量，從而增強(qiáng)傳統(tǒng)的離線分析，幫助進(jìn)一步了解該過程。

近紅外（NIR）、中紅外（MIR）、拉曼光譜（Raman）和熒光光譜（Fluorescent）等光譜分析方法在生物過程監(jiān)測(cè)和控制方面取得了進(jìn)展。近幾十年來，拉曼光譜技術(shù)以其化學(xué)特異性高、受水干擾小等優(yōu)點(diǎn)，在生物制藥領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。拉曼光譜的應(yīng)用有助于實(shí)現(xiàn)原位測(cè)量，使實(shí)時(shí)過程控制成為一種可期的PAT工具。然而，拉曼光譜是否可以用于灌流細(xì)胞培養(yǎng)以自動(dòng)控制VCD還沒有研究。

在灌流細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中，交替切向流（ATF）系統(tǒng)是一種穩(wěn)健且可擴(kuò)展的過濾系統(tǒng)，它使用中空纖維膜和交替切向流以相對(duì)低的剪切力實(shí)現(xiàn)高效的細(xì)胞保留。在生物反應(yīng)器中保存細(xì)胞的同時(shí)，提取含有抗體和乳酸、銨等栓塞物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)液。活細(xì)胞密度（VCD）和總細(xì)胞密度（TCD）通常被設(shè)定為細(xì)胞培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵性能參數(shù)，對(duì)VCD和TCD的監(jiān)測(cè)對(duì)于確定培養(yǎng)階段和異常事件具有極其重要的意義。在灌流細(xì)胞培養(yǎng)中保持適當(dāng)?shù)幕罴?xì)胞密度和總細(xì)胞密度有利于細(xì)胞狀態(tài)，有助于降低由交替切向流（ATF）膜污染引起的產(chǎn)物滯留，并產(chǎn)生高生產(chǎn)率。目前，生物量探針還可以在線測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)過程中的VCD和TCD。許多研究人員證明生物量探測(cè)器可以幫助他們監(jiān)控VCD的實(shí)時(shí)變化，從而幫助他們開發(fā)出更穩(wěn)健的工藝。然而，細(xì)胞培養(yǎng)過程非常復(fù)雜，細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、生化和生產(chǎn)率以及產(chǎn)品質(zhì)量都對(duì)制造業(yè)的成功具有重要意義。拉曼光譜使傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)過程只需一個(gè)探針就能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)甚至控制許多參數(shù)，大大簡(jiǎn)化了PAT的復(fù)雜性。

Abu-Absi等人于2011年報(bào)道了原位拉曼測(cè)量結(jié)果。他們借助拉曼光譜和偏最小二乘（PLS）模型，在500L生物反應(yīng)器的規(guī)模上成功地在線測(cè)量了葡萄糖、銨離子、乳酸的濃度以及活細(xì)胞密度（VCD）和總細(xì)胞密度（TCD）。此外，他們還提出了基于拉曼光譜的過程開發(fā)的即時(shí)反饋策略的可能性。證明了這些參數(shù)的校準(zhǔn)模型可以從3L擴(kuò)展到15L。2014年，Berry等人基于在5L生物反應(yīng)器中校準(zhǔn)的Raman模型，通過在200L和2000L中的跨尺度預(yù)測(cè)，表明VCD和TCD的模型具有尺度依賴性。其他代謝物，如葡萄糖，乳酸和滲透壓模型顯示了跨尺度預(yù)測(cè)的巨大性能。為了進(jìn)一步證明拉曼光譜的準(zhǔn)確性，他們創(chuàng)建了一個(gè)基于拉曼的葡萄糖濃度反饋控制和乳酸回路控制模式。此外，利用拉曼光譜儀對(duì)抗體滴度進(jìn)行原位和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的應(yīng)用于2015年得到證實(shí)。André等人[14]基于拉曼光譜實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗體效價(jià)濃度。他們相信這種方法可以為建立以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和控制的方式優(yōu)化重組抗體生產(chǎn)的反饋回路奠定基礎(chǔ)。

拉曼技術(shù)在預(yù)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)階段的純度方面也顯示出巨大的潛力，Ashton等人在2014年展示了紫外共振拉曼（UVRR）光譜在蛋白質(zhì)純化澄清步驟前后監(jiān)測(cè)可能污染細(xì)胞培養(yǎng)基的殘余DNA和RNA變化的潛力。Singh等人利用拉曼光譜和CLS算法在細(xì)胞分批培養(yǎng)中高精度地測(cè)定葡萄糖和乳酸，同時(shí)他們還為定義明確的化學(xué)物質(zhì)建立了一個(gè)自制的拉曼光譜庫(kù)。

近年來，拉曼光譜儀作為一種實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模的可靠的PAT工具被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)中。Liu等人利用相關(guān)優(yōu)化彎曲（COW）方法對(duì)正常工作條件（NOC）批次的不同時(shí)間間隔的拉曼數(shù)據(jù)集進(jìn)行同步，建立了多元統(tǒng)計(jì)過程控制（MSPC）模型，該模型能夠識(shí)別生物反應(yīng)器是否受到污染等異常工況。Santos等人在2018年開發(fā)了一種新的代謝物建模策略，利用樣本打擊方法。作者嘗試將指紋拉曼光譜區(qū)域分配和成分尖峰研究結(jié)合起來，以提高模型預(yù)測(cè)能力和特異性。比較了前向區(qū)間偏最小二乘（iPLS）、PLS投影變量重要性（V.I.P）和選擇比（SR）三種數(shù)據(jù)分析方法對(duì)模型參數(shù)的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)iPLS和V.I.P在模型預(yù)測(cè)性能上更具前景。

灌流細(xì)胞培養(yǎng)作為一種連續(xù)過程的策略，近年來得到了廣泛的應(yīng)用，并因其較高的產(chǎn)品收率和穩(wěn)定的PQA而受到廣泛關(guān)注。ATF裝置可去除抑制性副產(chǎn)物，如乳酸、銨、溶解二氧化碳和其他副產(chǎn)物的積累，同時(shí)不斷添加新鮮營(yíng)養(yǎng)素。采用灌流策略，在小型生物反應(yīng)器中可以獲得更高的細(xì)胞數(shù)和產(chǎn)量。與補(bǔ)料相比，灌流時(shí)細(xì)胞密度高達(dá)2.14×10⁸個(gè)細(xì)胞/mL，產(chǎn)品效價(jià)高達(dá)25g/L。通常，灌流過程通過引入細(xì)胞流出來維持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，從而在特定的靶細(xì)胞密度下進(jìn)行，同時(shí)，由于產(chǎn)品保留時(shí)間較短，因此保持了重組蛋白的穩(wěn)定性和質(zhì)量。

在最近的FDA關(guān)于連續(xù)生產(chǎn)的指導(dǎo)意見中，強(qiáng)調(diào)了產(chǎn)品質(zhì)量問題，該指導(dǎo)意見建議應(yīng)用過程監(jiān)控和使用PAT工具，以幫助生成有關(guān)于輸入物料、過程中物料和最終產(chǎn)品的過程參數(shù)和屬性的實(shí)時(shí)信息，這將為高檢測(cè)能力的瞬時(shí)干擾、過程偏差、動(dòng)態(tài)過程控制、更準(zhǔn)確的物料偏移和實(shí)時(shí)放行測(cè)試（RTRT）照亮道路。因此，F(xiàn)DA希望通過QbD和PAT等增強(qiáng)型開發(fā)方法對(duì)藥品生產(chǎn)進(jìn)行連續(xù)化生產(chǎn)，以減少藥品質(zhì)量問題，降低生產(chǎn)成本。然而，由于灌流設(shè)備的復(fù)雜性和無(wú)菌性的挑戰(zhàn)，在灌流細(xì)胞培養(yǎng)過程中很少使用原位和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PAT工具。到目前為止，大多數(shù)灌注細(xì)胞培養(yǎng)仍然依賴于傳統(tǒng)的人工取樣和離線/近線測(cè)量，這可能導(dǎo)致離線采樣后很長(zhǎng)時(shí)間的延遲，使得必要時(shí)很難采取糾正措施，增加了批風(fēng)險(xiǎn)。此外，人工取樣會(huì)帶來更多可能導(dǎo)致污染的人為錯(cuò)誤風(fēng)險(xiǎn)。因此，在灌流細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用拉曼光譜等PAT工具勢(shì)在必行。

此研究首先采用拉曼光譜法對(duì)葡萄糖、乳酸、銨離子、鈉離子、鉀離子等代謝物在灌注流細(xì)胞培養(yǎng)中的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。比較了幾種活細(xì)胞密度（VCD）的建模方法，選擇了拉曼反饋控制方法。建立了灌流細(xì)胞培養(yǎng)-拉曼集成系統(tǒng)，成功地進(jìn)行了11天的VCD在線自動(dòng)控制。

2. 方法

2.1 材料

生物過程控制器系統(tǒng)：Finesse G3實(shí)驗(yàn)室通用控制器、TruBio Delta V 5.0控制軟件、3L Applikon玻璃生物反應(yīng)器。ATF系統(tǒng)：Repligen交替切向流（ATF，Repligen，Pine Brook，NJ）系統(tǒng)，其中中空纖維模塊由孔徑為0.22μm的聚醚砜（PES）組成、 纖維直徑為1 mm，過濾器尺寸為0.47 m2。拉曼系統(tǒng)：Kaiser RAMANRXN2多通道拉曼分析儀（Kaiser Optical Systems，Inc.，Ann Arbor，MI），激光激發(fā)波長(zhǎng)785nm，最多四個(gè)bIO LAB-220探針。采用SIMCA14.1.2軟件進(jìn)行建模。OPC連接系統(tǒng)：Raman RunTime中的嵌入式OPC服務(wù)器，MatrikonOPC數(shù)據(jù)管理軟件（MatrikonOPC，加拿大艾伯塔省埃德蒙頓）。細(xì)胞系和培養(yǎng)基：表達(dá)人IgG1單克隆抗體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系，商業(yè)化成分明確的基礎(chǔ)和補(bǔ)料培養(yǎng)基。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用3LApplikon臺(tái)式生物反應(yīng)器（工作體積為1500ml）灌流培養(yǎng)產(chǎn)IgG1單克隆抗體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系，采用商品化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行灌流。生物反應(yīng)器的運(yùn)行溫度為34.5℃。在整個(gè)培養(yǎng)過程中pH和DO保持穩(wěn)定。攪拌設(shè)定為250 RPM。

生物反應(yīng)器的接種密度約為0.5× 10⁶細(xì)胞/mL。第2天VCD達(dá)到約2.0× 10⁶時(shí)開始基礎(chǔ)培養(yǎng)基灌注，VCD大于50× 106細(xì)胞/mL時(shí)開始流加補(bǔ)料。細(xì)胞在兩個(gè)3L生物反應(yīng)器中采用相同的灌流培養(yǎng)方式和培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，反應(yīng)器控制器標(biāo)記為FC0A和FC0B進(jìn)行區(qū)別。

使用ATF2細(xì)胞保留系統(tǒng)和聚醚砜過濾器（孔徑：0.2μm）進(jìn)行灌注培養(yǎng)、 膜面積：0.47 m2。對(duì)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)料，灌流率在0.6到1.5新鮮培養(yǎng)基體積/生物反應(yīng)器每天工作體積（VVD）之間變化。對(duì)于補(bǔ)料培養(yǎng)基，灌流速率在0.2～0.4VVD之間，以14.4min的間隔進(jìn)行半連續(xù)補(bǔ)加，細(xì)胞流加通過精細(xì)控制器控制的蠕動(dòng)泵進(jìn)行。

這兩個(gè)生物反應(yīng)器每天進(jìn)行兩次無(wú)菌取樣，進(jìn)行離線分析，然后用于建模。取樣后，約2ml無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)液樣品直接送（RAPIDLab® 348EX BGA，Siemens），用于pH、pCO2、pO2、Na⁺、k⁺測(cè)量。用Vi-CELL（Vi-CELL，BECKMAN）測(cè)定細(xì)胞密度、活力和細(xì)胞直徑。葡萄糖，用Cedex（Cedex-Bio-HT，Roche）測(cè)定乳酸、NH4⁺和效價(jià)。通過滲透壓計(jì)（Model 2020，Advanced Instruments）測(cè)量滲透壓。

2.3拉曼光譜的獲得

在線拉曼測(cè)量由Kaiser RAMANRXN2多通道拉曼分析儀（Kaiser Optical Systems，Inc.，Ann Arbor，MI）進(jìn)行，激光激發(fā)波長(zhǎng)為785nm。一個(gè)拉曼分析儀支持多達(dá)4個(gè)探針，因此它能夠監(jiān)測(cè)多達(dá)4個(gè)探頭。因此它能夠?qū)IO-LAB-220探針浸入3L臺(tái)式Applikon玻璃生物反應(yīng)器中，同時(shí)檢測(cè)多達(dá)4個(gè)生物反應(yīng)器。還使用了典型的200mw激光功率。每條拉曼光譜都是用10秒的曝光時(shí)間和75次積累收集的。采集模式是連續(xù)的。也采用了暗光譜減法和宇宙射線濾波器。每個(gè)光譜總共用了大約13分鐘來獲得。分析儀在使用前進(jìn)行校準(zhǔn)，每天進(jìn)行一次自動(dòng)校準(zhǔn)，以確保整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過程中波長(zhǎng)的準(zhǔn)確性。

2.4化學(xué)計(jì)量學(xué)模型

收集的拉曼光譜與離線進(jìn)行的各種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量相關(guān)。光譜和測(cè)量的生化數(shù)據(jù)使用Umetrics的SIMCA14.1.2進(jìn)行分析和處理。首先利用光譜濾波模塊對(duì)校準(zhǔn)光譜進(jìn)行預(yù)處理，然后用偏最小二乘（PLS）回歸方法將校準(zhǔn)光譜與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行關(guān)聯(lián)。對(duì)于用于拉曼光譜的PLS模型，它是一個(gè)一般的線性回歸模型，通過將預(yù)測(cè)變量（VCD、葡萄糖、乳酸……）和可觀測(cè)變量（不同拉曼位移下的拉曼強(qiáng)度）投影到一個(gè)新的空間，PLS模型的主要參數(shù)是加載矩陣和殘差矩陣。在建模過程中，參數(shù)由觀測(cè)到的y變量及其對(duì)應(yīng)的x變量擬合而成。通過減小預(yù)測(cè)Y與實(shí)測(cè)Y之間的誤差，自動(dòng)獲得參數(shù)。

影響模型質(zhì)量的主要因素是拉曼光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理方法和x-block的選取。如圖3所示，對(duì)于不同的目標(biāo)（Y），基于統(tǒng)計(jì)性能，選擇拉曼數(shù)據(jù)預(yù)處理方法和x-block范圍，即Y中的交叉驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）（公式1）（1），其中n等于樣本數(shù)，i等于當(dāng)前樣本，y_i是測(cè)量參數(shù)，是預(yù)測(cè)參數(shù)。對(duì)于交叉驗(yàn)證，使用交叉驗(yàn)證計(jì)算測(cè)試/訓(xùn)練集的RMSE。以RMSECV模型作為最終的代謝物預(yù)測(cè)模型。

對(duì)拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理對(duì)于建立一個(gè)性能良好的模型非常重要。本研究中常用的預(yù)處理方法是標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量（SNV）和導(dǎo)數(shù)，這些方法用于歸一化輪廓、減小信號(hào)基線偏移、減小瑞利散射和背景噪聲的影響。根據(jù)統(tǒng)計(jì)模型性能（RMSECV），選擇一階或二階導(dǎo)數(shù)濾波器對(duì)不同的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行建模。對(duì)于光譜區(qū)域的選擇，重要的是去除主要由噪聲、偽影、瑞利散射或其他非拉曼特征組成的光譜區(qū)域。一般建模限于拉曼光譜的指紋區(qū)域或根據(jù)V.I.P指數(shù)進(jìn)行選擇。在本研究中，常用的x-block范圍為800–1800 cm^-1或800-3400cm^-1、投影指標(biāo)（V.I.P）的變量重要性也是統(tǒng)計(jì)上細(xì)化x-block組選擇的指標(biāo)。通常建立多個(gè)模型，由最小RMSECV選擇理想模型。

經(jīng)過預(yù)處理和光譜區(qū)域選擇，建立了葡萄糖、乳酸、NH4+和活細(xì)胞密度（VCD）等的獨(dú)立PLS模型。通過顯示交叉驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）和預(yù)測(cè)均方根（RMSEP）的觀察圖和預(yù)測(cè)圖對(duì)模型結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。另一個(gè)重要的診斷工具，即Hotelling的T2圖，可以用來理解模型的超結(jié)構(gòu)和檢測(cè)異常值。

2.5 拉曼光譜與生物過程控制器的集成

Raman運(yùn)行時(shí)系統(tǒng)提供嵌入式OPC-UA服務(wù)器。Finesse Trubio配有OPC DA服務(wù)器，因此可以通過MatrikonOPC數(shù)據(jù)管理器獲得預(yù)測(cè)值。集成和反饋控制回路如圖1所示。如圖1所示，該控制策略存在兩個(gè)邏輯回路。一種稱為過程控制回路，在3L生物反應(yīng)器中以恒定的頻率獲得拉曼信號(hào)，然后將其傳輸?shù)街鳈C(jī)，即運(yùn)行時(shí)系統(tǒng)，主機(jī)中的SimcaKaiser模塊讀取光譜文件并將其轉(zhuǎn)換為預(yù)測(cè)值，然后這些值通過本地網(wǎng)絡(luò)傳輸?shù)組atrikonOPC數(shù)據(jù)管理器，最終Finesse TruBio DeltaV系統(tǒng)讀取這些值并啟動(dòng)我們自定義的VCD自動(dòng)排放邏輯，該邏輯回路實(shí)現(xiàn)VCD的在線自動(dòng)控制。第二個(gè)是建模循環(huán)，一旦需要建立一個(gè)新模型，就必須啟動(dòng)這個(gè)循環(huán)。

2.6 VCD自動(dòng)反饋控制

穩(wěn)定灌流培養(yǎng)的目標(biāo)VCD設(shè)置為50×10⁶個(gè)活細(xì)胞/mL。當(dāng)VCD自動(dòng)控制啟動(dòng)，在線VCD增加到目標(biāo)VCD以上時(shí)，控制邏輯觸發(fā)工作。將目標(biāo)VCD與Raman在線VCD之間的誤差引入P.I.D算法中，將泵速級(jí)聯(lián)，并與PID算法的輸出成比例。為了保證自動(dòng)控制過程的穩(wěn)健性，一旦在線和離線測(cè)量VCD的差值大于5×10⁶個(gè)活細(xì)胞/m，意味著預(yù)測(cè)的VCD將失去其準(zhǔn)確性，將新的數(shù)據(jù)加入到VCD的PLS模型的數(shù)據(jù)集中，以提高模型的準(zhǔn)確性。

3. 結(jié)果

3.1 灌流細(xì)胞培養(yǎng)的拉曼光譜

一次灌注實(shí)驗(yàn)的拉曼光譜原始數(shù)據(jù)如圖2所示，其中y軸表示拉曼強(qiáng)度，x軸表示從100 cm^-1開始的拉曼位移至3400cm^-1。圖中的每一行代表一條拉曼曲線，此時(shí)的顏色表示測(cè)得的活細(xì)胞密度（VCD）。

3.2 灌流細(xì)胞培養(yǎng)關(guān)鍵生化指標(biāo)的預(yù)測(cè)

為了驗(yàn)證利用拉曼光譜監(jiān)測(cè)灌注細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵生化指標(biāo)，即IgG濃度、細(xì)胞活力、葡萄糖、乳酸、NH4⁺、滲透壓、Na⁺、K⁺和pCO2的可能性，根據(jù)FC0A的數(shù)據(jù)建立了各種PLS模型。它們?cè)跍y(cè)試集（FC0B）上的性能如圖3所示。

如圖3和表1所示，IgG的PLS模型，可接受的預(yù)測(cè)RMSEP為147.48 mg/L，誤差主要?dú)w因于ATF柱的產(chǎn)物保留率隨時(shí)間變化。與Li等人對(duì)補(bǔ)料分批培養(yǎng)的良好細(xì)胞活力預(yù)測(cè)（平均誤差：2.5%）相比，我們的細(xì)胞活力預(yù)測(cè)模型在灌流培養(yǎng)中沒有這么好的表現(xiàn)。細(xì)胞存活率的預(yù)測(cè)結(jié)果不令人滿意，RMSEP為39%，這表明細(xì)胞存活率不僅受細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝狀況或外界環(huán)境的影響，而且與基礎(chǔ)補(bǔ)加速率、排放速率密切相關(guān)，因此需要進(jìn)一步的工作來優(yōu)化模型?？紤]到這些PLS模型只在一個(gè)批次內(nèi)進(jìn)行了校準(zhǔn)，并且在灌流培養(yǎng)模式下預(yù)測(cè)更具挑戰(zhàn)性，對(duì)于葡萄糖和乳酸等溶質(zhì)，在測(cè)試集上的預(yù)測(cè)性能是可以接受的。

值得注意的是，從第26天到第45天預(yù)測(cè)偏差可能是由于模型擬合不足和批次間的差異造成的。模型對(duì)第1天到第19天的葡萄糖濃度進(jìn)行了準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)，但第19天以后隨著生物反應(yīng)器中葡萄糖濃度逐漸下降到0，表現(xiàn)為葡萄糖進(jìn)料、出料和消耗的動(dòng)態(tài)平衡。我們推測(cè)培養(yǎng)基的異質(zhì)性導(dǎo)致了葡萄糖濃度預(yù)測(cè)誤差的增加。與補(bǔ)料分批模式下的葡萄糖預(yù)測(cè)相比，葡萄糖預(yù)測(cè)更具挑戰(zhàn)性，尤其是在表觀葡萄糖濃度幾乎保持不變的穩(wěn)定階段。

拉曼光譜對(duì)NH4⁺、Na⁺、K⁺也有很好的結(jié)果。由于FC0A（訓(xùn)練集）和FC0B（測(cè)試集）的累積差異隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，預(yù)測(cè)的K⁺濃度在后期略有漂移。在滲透壓方面表現(xiàn)良好，RMSEP為5mosmo/kg，這意味著可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)滲透壓。同時(shí)，拉曼光譜也顯示了預(yù)測(cè)灌流培養(yǎng)時(shí)生物反應(yīng)器中pCO2的潛力。

3.3. 活細(xì)胞密度模型

為了實(shí)現(xiàn)VCD的自動(dòng)控制，獲得一個(gè)穩(wěn)健、準(zhǔn)確的PLS預(yù)測(cè)模型是非常重要的。對(duì)VCD的實(shí)時(shí)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)有助于控制器在過程在線控制回路中做出快速、正確的響應(yīng)。因此，比較了6種不同的拉曼信號(hào)預(yù)處理方法和數(shù)據(jù)源模型，即2種導(dǎo)數(shù)模型和3種數(shù)據(jù)源模型。數(shù)據(jù)源的變化會(huì)給模型的標(biāo)定空間帶來很大的差異，導(dǎo)致VCD預(yù)測(cè)模型性能的不同?？紤]到生物反應(yīng)器FC0A是為VCD自動(dòng)控制而設(shè)計(jì)的，因此VCD建?？紤]的數(shù)據(jù)源是FC0A中的歷史拉曼數(shù)據(jù)，這意味著根據(jù)FC0A從第1天到第50天的歷史數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)第51天的VCD。第二個(gè)數(shù)據(jù)源來自并聯(lián)的生物反應(yīng)器FC0B。訓(xùn)練模型的第三個(gè)數(shù)據(jù)源是來自FC0B和FC0A（第1-50天）的培養(yǎng)數(shù)據(jù)。

如圖4所示，所有6個(gè)PLS模型在訓(xùn)練集上都具有可接受的預(yù)測(cè)性能，特別是對(duì)于基于拉曼光譜的一階導(dǎo)數(shù)模型（左側(cè)）。同時(shí)，針對(duì)不同數(shù)據(jù)源的模型，將數(shù)據(jù)點(diǎn)分布在不同的范圍內(nèi)。更詳細(xì)地說，F(xiàn)C0A第1-50天的訓(xùn)練數(shù)據(jù)具有更均勻的VCD數(shù)據(jù)分布，而FC0B的訓(xùn)練數(shù)據(jù)具有更多位于VCD 45-60范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)點(diǎn)×10⁶細(xì)胞/mL。

如圖5所示，一般情況下，一階導(dǎo)數(shù)訓(xùn)練集的RMSECV（交叉驗(yàn)證均方根誤差）低于二階導(dǎo)數(shù)的RMSE。并從Hotelling的T-range2值方面對(duì)兩種導(dǎo)數(shù)方法進(jìn)行了比較。如圖6（a）所示，對(duì)于一階導(dǎo)數(shù)建立的模型，有些點(diǎn)超過了95%的置信限，說明一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理會(huì)影響模型的質(zhì)量。因此，從Hotelling的T2-range圖來看，二階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理優(yōu)于一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理。

以下是不同型號(hào)的VCD的性能測(cè)試結(jié)果。如圖7和圖8所示結(jié)果表明，由于數(shù)據(jù)預(yù)處理方法和數(shù)據(jù)來源的不同，預(yù)測(cè)VCD的PLS模型具有不同的測(cè)試性能。對(duì)于拉曼光譜在流加分批細(xì)胞培養(yǎng)VCD預(yù)測(cè)中的應(yīng)用，Nicholas在驗(yàn)證集中獲得了14.5%的RMSE，其中3批用于模型訓(xùn)練。Aditya對(duì)VCD模型進(jìn)行了實(shí)時(shí)校正，得到了較好的結(jié)果，這意味著模型是基于一個(gè)大數(shù)據(jù)集進(jìn)行訓(xùn)練的，在驗(yàn)證集中得到了1.3%的RMSE。對(duì)于模型訓(xùn)練數(shù)據(jù)有限的灌流細(xì)胞培養(yǎng)，本研究的VCD模型RMSEP為4.20×10⁶個(gè)活細(xì)胞/mL，相對(duì)RMSEP為8.3%，說明我們的VCD模型是準(zhǔn)確的。

值得注意的是，對(duì)拉曼光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理的PLS模型預(yù)測(cè)的RMSE均低于一階導(dǎo)數(shù)，一階導(dǎo)數(shù)的預(yù)測(cè)VCD均被高估，說明在我們的情況下，拉曼光譜的一階導(dǎo)數(shù)會(huì)引入建模偏差。此外，二階導(dǎo)數(shù)消除了這一偏差，但方差隨著預(yù)測(cè)VCD的波動(dòng)而增大。

另外，數(shù)據(jù)源對(duì)VCD的預(yù)選性能也有一定的影響。FC0A和FC0B是兩個(gè)具有相同起始點(diǎn)（接種密度、DO設(shè)定點(diǎn)、pH策略、溫度設(shè)定）的批次。然而，這種差異隨著時(shí)間的推移而增加，例如從第22天到第30天，由于乳酸的積累，F(xiàn)C0A的pH值從7.1降至6.8，但FC0B的pH值保持在7.1左右的穩(wěn)定（圖S1）。如果用FC0B訓(xùn)練模型，兩批之間的差異會(huì)導(dǎo)致VCD的預(yù)測(cè)性能變差。因此，歷史數(shù)據(jù)比另一批（FC0B）的數(shù)據(jù)要好得多，考慮到早期灌細(xì)胞培養(yǎng)過程發(fā)展階段的批間差異是合理的。此外，圖8的結(jié)果還表明，將FC0B中的數(shù)據(jù)放入FC0A生成的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中并沒有提高性能。

3.4. VCD的自動(dòng)控制

如前所述，使用FC0A數(shù)據(jù)的二階導(dǎo)數(shù)模型或使用FC0A和FC0B數(shù)據(jù)訓(xùn)練的二階導(dǎo)數(shù)模型具有相當(dāng)?shù)念A(yù)測(cè)性能。所以我們選擇了具有FC0A數(shù)據(jù)的二階導(dǎo)數(shù)模型，我們假設(shè)歷史數(shù)據(jù)本身不會(huì)給VCD模型帶來額外的偏差。

如圖9所示，該圖顯示了我們?nèi)绾卧诠嗔骷?xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)自動(dòng)排放。首先，將培養(yǎng)基連續(xù)注入生物反應(yīng)器，在ATF細(xì)胞保留系統(tǒng)的幫助下連續(xù)收獲產(chǎn)品。在VCD的自動(dòng)控制之前，細(xì)胞以恒定的泵速?gòu)纳锓磻?yīng)器中排出，需要定期修改。拉曼光譜可以預(yù)測(cè)代謝物和VCD，并通過OPC連接將值傳遞給deltaV控制器。在deltaV控制器中，細(xì)胞放氣泵的設(shè)定值被級(jí)聯(lián)到VCD模塊的PID輸出。如圖10所示，兩種將泵級(jí)聯(lián)到VCD PID輸出的一般方法被應(yīng)用于VCD自動(dòng)控制。1） 從第51天到第56天，泵的速率被限制在10~20 g/h，以確保過程的穩(wěn)健，因此泵的工作就像“啟動(dòng)”和“打開”狀態(tài)之間的開關(guān)。2） 在第56天之后，在deltaV系統(tǒng)的幫助下應(yīng)用另一個(gè)VCD自動(dòng)控制策略，VCD PID輸出根據(jù)泵速率使用以下等式進(jìn)行縮放：，其中泵速（g/h）是指泵的排放速率，PID輸出（0-100）是指通過OPC連接從拉曼分析儀傳輸?shù)絛eltaV系統(tǒng)的在線VCD信號(hào)的PID輸出。這樣，排放速率應(yīng)在0.48VVD左右，并假定該控制回路對(duì)在線VCD的變化更為敏感。VCD的自動(dòng)控制結(jié)果如圖10所示，目標(biāo)VCD被設(shè)置為50× 10⁶細(xì)胞/mL，這是灌流細(xì)胞培養(yǎng)的常見設(shè)置。與紅色填充圓相比，藍(lán)線指示的預(yù)測(cè)VCD值是可接受的。而且，預(yù)測(cè)值圍繞目標(biāo)VCD波動(dòng)，即50× 10⁶個(gè)活細(xì)胞/mL。一旦在線預(yù)測(cè)VCD高于50× 10⁶個(gè)細(xì)胞/mL，泵將如上所述開始工作。在P.I.D控制策略的幫助下，當(dāng)更新的VCD降低到目標(biāo)VCD時(shí)，泵速逐漸減小到0。如圖10所示，很明顯離線VCD在目標(biāo)VCD周圍具有更高的振幅，這表明未來的工作需要更多的優(yōu)化。此外，從第51天到第56天，VCD控制算法運(yùn)行良好，從第56天到第62天，采用第二種VCD控制方法，在線VCD和離線VCD都在目標(biāo)VCD附近波動(dòng)，除了一個(gè)異常值。第59天的異常值應(yīng)歸因于VCD測(cè)量誤差。因此VCD控制算法從第51天到第62天有效地工作。

表2中的結(jié)果還顯示，從第51天到第62天，在線和離線的受控VCD值的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.76和2.67，這與圖10中的趨勢(shì)一致。在線VCD和離線VCD預(yù)測(cè)值的平均值都穩(wěn)定地保持在目標(biāo)VCD，分別為50.98× 10⁶個(gè)活細(xì)胞/mL和50.67× 10⁶個(gè)活細(xì)胞/mL。因此，本研究成功地開發(fā)出一套可行的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液灌流VCD自動(dòng)控制策略。

4. 結(jié)論

此次研究建立了灌流細(xì)胞培養(yǎng)-拉曼集成系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了關(guān)鍵代謝物的在線監(jiān)測(cè)和活細(xì)胞密度的自動(dòng)控制。與生物量探針、pCO2探針、葡萄糖/乳酸探針等細(xì)胞培養(yǎng)過程中的PAT技術(shù)相比，多功能PAT技術(shù)在降低操作復(fù)雜度的同時(shí)，具有更大的應(yīng)用前景。結(jié)果表明，用一批剛校準(zhǔn)的模型，RMSEP分別為0.71g/L、0.24g/L、5mosmo/kg和147.48mg/L，可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)葡萄糖、乳酸、滲透壓和IgG濃度。另外，pCO2、Na⁺和K⁺等參數(shù)的預(yù)測(cè)精度也可以接受。

結(jié)果還表明，對(duì)拉曼光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理比一階導(dǎo)數(shù)具有更好的VCD預(yù)測(cè)性能，批次本身的歷史數(shù)據(jù)比平行批次的VCD建模和標(biāo)定性能更好，這意味著對(duì)模型輸入變量進(jìn)行細(xì)致的統(tǒng)計(jì)篩選以及數(shù)據(jù)預(yù)處理方法對(duì)模型性能有著重要的影響。提出了一種可行的灌流哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)VCD的自動(dòng)控制策略，即在線和離線VCD保持在目標(biāo)VCD為50×10⁶個(gè)活細(xì)胞/mL，即對(duì)應(yīng)11天分別為50.98±1.76個(gè)活細(xì)胞/mL和50.67 ±2.67個(gè)活細(xì)胞/mL。這些工作為PAT在生物制品連續(xù)生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，顯示了實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)產(chǎn)品質(zhì)量的巨大潛力，為解決生物制品連續(xù)生產(chǎn)中的質(zhì)量問題提供了穩(wěn)健的工具。