慢病毒載體(Lentiviral vectors, LVs)是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，最被廣泛應(yīng)用的慢病毒載體是基于雙鏈RNA病毒人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）^[1]。HIV-1型慢病毒載體系統(tǒng)的建立，經(jīng)歷了一個逐步完善的過程，其生物安全性不斷提高。

LVs對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，更加安全，并可以在體內(nèi)長期的表達(dá)。這一特性使LVs成為臨床研究的理想選擇，美國食品和藥物管理局(FDA)和歐洲藥物管理局(EMA)已經(jīng)批準(zhǔn)多個以慢病毒為基礎(chǔ)的基因療法。目前，LVs在β-地中海貧血（β-thalassemia）、鐮狀細(xì)胞性貧血（Sickle cell anemia）、實(shí)體瘤（Solid tumors）等疾病（圖1）的細(xì)胞和基因治療中得到了廣泛的應(yīng)用，如CAR-T細(xì)胞治療。

圖1：使用LVs的臨床試驗(yàn)數(shù)量最多的主要疾病^[2]

臨床試驗(yàn)需要大量功能性慢病毒顆粒，提高慢病毒的包裝與生產(chǎn)水平可有效促進(jìn)慢病毒介導(dǎo)的基因治療的發(fā)展。LVs通常是通過將編碼載體組分的多質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到貼壁HEK293T細(xì)胞中來生產(chǎn)。瞬時轉(zhuǎn)染的方式需要耗費(fèi)很高的成本和很長的時間來獲取質(zhì)粒DNA，從而使生產(chǎn)過程極其昂貴；在放大過程中，質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的殘留，也會引起終產(chǎn)物的污染。相較于瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)，穩(wěn)定的慢病毒生產(chǎn)才是基因治療的更優(yōu)選擇。穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞株將其所有載體編碼的DNA都穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞基因組中，可以降低生產(chǎn)成本、提高整體安全性和可重復(fù)性。

英國的葛蘭素史克藥物研究中心報告了一種通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染編碼所有慢病毒載體成分的單個 DNA 結(jié)構(gòu)體到 293T 細(xì)胞，快速生成穩(wěn)定生產(chǎn)慢病毒載體的細(xì)胞系的方法。由此產(chǎn)生的穩(wěn)定懸浮細(xì)胞系可生產(chǎn)出與瞬時轉(zhuǎn)染一樣高滴度的慢病毒，可以在一次性攪拌式生物反應(yīng)器中輕松放大，并且在后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中遺傳和功能穩(wěn)定。通過在慢病毒載體的上游加工過程中消除對有效瞬時轉(zhuǎn)染的要求，并改用固有的可擴(kuò)展懸浮細(xì)胞培養(yǎng)形式，他們認(rèn)為這種方法將生產(chǎn)出比當(dāng)前制造工藝更高的批量產(chǎn)量，并使患者能夠更好地獲得基于慢病毒載體的藥物^[3]。

LVs生產(chǎn)細(xì)胞株通常是基于順序穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或?qū)⒕幋a每個載體組分(轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒gagpol-rev和包膜質(zhì)粒VSVg)的DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到基因組不同位點(diǎn)的宿主細(xì)胞。這種策略導(dǎo)致細(xì)胞系開發(fā)時間長，并且至少有一個基因座可能發(fā)生遺傳或轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的高風(fēng)險，從而導(dǎo)致生產(chǎn)力損失。為了避免這種情況，GSK使用第三代慢病毒載體系統(tǒng)，載體組件由四個獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元編碼，每個單元都有自己的啟動子和多聚腺苷酸化信號，防止產(chǎn)生復(fù)制能力強(qiáng)的慢病毒(RCL)顆粒，一個將所有的載體成分構(gòu)建成單個大DNA結(jié)構(gòu)（BAC）并整合入宿主細(xì)胞（圖2）。

圖2：BAC載體結(jié)構(gòu)

利用微滴式數(shù)字PCR (ddPCR)定量每個載體成分DNA拷貝數(shù)，每個成分的拷貝數(shù)在1到10拷貝數(shù)/細(xì)胞之間變化（圖4A）。通過靶向位點(diǎn)擴(kuò)增技術(shù)（Targeted locus amplification，TLA）對293Tsa EGFP clone 2的BAC DNA進(jìn)行整合位點(diǎn)定位，在chr3:169,967,149-169,967,179處發(fā)現(xiàn)了一個整合位點(diǎn)（圖4B），在293Tsa GLOBE clone 19中，于chrl: 146,557,007和chrX: 127,363,436處發(fā)現(xiàn)了兩個整合位點(diǎn)（圖4C），表明BAC DNA在隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組之前發(fā)生了異位串聯(lián)，轉(zhuǎn)染圓形的BAC DNA質(zhì)粒，宿主的DNA修復(fù)蛋白會對其進(jìn)行重排，從而產(chǎn)生線性整合DNA。

以MOI=50或100的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34⁺細(xì)胞，通過qPCR檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的載體拷貝數(shù)(VCN)，重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)使得每個細(xì)胞產(chǎn)生2個拷貝的VCN，表明穩(wěn)定的細(xì)胞系產(chǎn)生的病毒載體可以感染類似難以感染的原代細(xì)胞(圖4D)。

圖4：293Tsa EGFP clone 2和293Tsa GLOBE clone 19

構(gòu)建相同的4質(zhì)粒系統(tǒng)瞬時轉(zhuǎn)染293Tsa細(xì)胞，通過RNA測序(RNA-seq)來定量各載體組分的RNA水平。各組分的RNA瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)之間沒有顯著差異，只有293Tsa GLOBE clone 19的rev表達(dá)升高(rev比瞬時表達(dá)高2.88倍，p = 0.0003)；并且，穩(wěn)定克隆的不同培養(yǎng)瓶之間每個載體組分的RNA表達(dá)水平的變異性顯著低于瞬時表達(dá)(p < 0.001) (圖5A)。另外，瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)的慢病毒在病毒滴度效價方面均未觀察到顯著差異(圖5B)。

圖5：慢病毒穩(wěn)定表達(dá)與瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)對比

使用低溫儲存的12個單克隆細(xì)胞進(jìn)行排序，在15ml一次性攪拌槽微生物反應(yīng)器中制備慢病毒載體并檢測其病毒滴度（圖6A）。選取效價高的4個克隆（clone1, 3, 9, 10）連續(xù)搖瓶培養(yǎng)數(shù)周來評估病毒滴度和遺傳穩(wěn)定性，使用選取三個時間點(diǎn)，在誘導(dǎo)下，使用ddPCR和ELISA法對比病毒滴度，clone3, 9, 10的病毒滴度沒有顯著變化，clone1的滴度下降(p = 0.0011)（圖6B）；在相同的三個時間點(diǎn)，采集非誘導(dǎo)的細(xì)胞基因組DNA檢測BAC各基因拷貝數(shù)量變化，四個克隆在遺傳上都是穩(wěn)定的，既沒有丟失整合DNA編碼的載體成分，也沒有通過重復(fù)感染擴(kuò)增轉(zhuǎn)移載體拷貝數(shù)（VCN）（圖6B）。

圖6：293Tsa GLOBE.T87Q的病毒滴度和遺傳穩(wěn)定性

為了測定這些克隆細(xì)胞是否會產(chǎn)生RCL，采用產(chǎn)物增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄酶(PERT)檢測了12個樣品，這12個樣品分別來自293Tsa EGFP clone 2、GLOBE clone 19和GLOBE.T87Q clone 1、3、9和10這6個克隆細(xì)胞的的收集樣品和濃縮后樣品。結(jié)果顯示，這些穩(wěn)定生產(chǎn)的細(xì)胞系中都沒有檢測到RCL（表1）。

表1：RCL檢測結(jié)果

在GSK分享的單DNA分子BAC結(jié)構(gòu)中將CMV啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄單元以transfer-gagpol-VSVg-rev的順序首尾1:1:1:1相連排列，但是也發(fā)現(xiàn)，在相同的BAC轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，不同的單克隆細(xì)胞的每個載體基因DNA拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)水平存在差異。因此，在細(xì)胞系構(gòu)建的過程中，應(yīng)篩選足夠數(shù)量的克隆，以獲得一個mRNA表達(dá)水平理想的克隆，獲得良好的產(chǎn)量和感染性。將BAC結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)?zāi)軌驈膸资畟€單克隆細(xì)胞系中篩選出高產(chǎn)的克隆，因此GSK認(rèn)為，這種包裝細(xì)胞系的方法能夠減少克隆之間變異。未來也可以進(jìn)一步的載體改造，將其中的基因片段用改進(jìn)的基因進(jìn)行替換，快速利用多個片段組裝或基因合成為一個BAC片段，單次的轉(zhuǎn)染能簡化并加速慢病毒穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建流程，提高慢病毒載體的產(chǎn)量、質(zhì)量和安全性。FDA和EMA也認(rèn)為這種穩(wěn)定生產(chǎn)慢病毒的細(xì)胞系平臺可用于生產(chǎn)臨床使用的慢病毒，也沒有提出慢病毒載體制造工藝之外的要求。這種簡單有效的生產(chǎn)細(xì)胞株培養(yǎng)技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于慢病毒載體制造的產(chǎn)業(yè)化，并有可能在未來為更多的患者提供基因治療藥物。

瞬時轉(zhuǎn)染為基礎(chǔ)的慢病毒載體制造工藝用于臨床是基因治療領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，但通常需要大量GMP級別的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑。相比較之下，構(gòu)建穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞株更適合于大規(guī)模的慢病毒的生產(chǎn)，建高產(chǎn)細(xì)胞株的主要流程如圖6所示，經(jīng)過單克隆細(xì)胞篩選、擴(kuò)增培養(yǎng)和驗(yàn)證，最終獲得細(xì)胞活力高、生長能力強(qiáng)，并且表達(dá)水平、穩(wěn)定性、質(zhì)量情況都具有優(yōu)質(zhì)表現(xiàn)的單克隆細(xì)胞株。

圖7：細(xì)胞系構(gòu)建的流程

GSK利用Cytena單細(xì)胞打印機(jī)替代常規(guī)的有限稀釋的方法篩選單克隆細(xì)胞，由于其溫和而高效的分選原理，使得單細(xì)胞率＞95%，克隆恢復(fù)率與有限稀釋相當(dāng)，獲得大量單克隆來源的細(xì)胞，并提供分選過程中的噴嘴圖片作為單克隆細(xì)胞來源的佐證，進(jìn)一步加速慢病毒生產(chǎn)細(xì)胞株構(gòu)建的工作流程，促進(jìn)基因與細(xì)胞治療的發(fā)展。