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基因與細胞治療領域的病毒載體生產用細胞株的開發

來源:廣州市艾貝泰生物科技有限公司   2022年09月29日 10:51  
基因治療被認為是許多嚴重的和危及生命的疾病有效治療手段,得到越來越多人的關注。同時,基因治療的適應癥正從罕見/極罕見疾病向更常見疾病發生轉變,患者數量和綜合療法越來越多。因而,大規模的基因治療病毒載體生產是行業的迫切需求。

2020年,FDA更新了關于基因治療臨床試驗申請(INDs)的化學、制造和控制指導原則,內容包含穩轉細胞株開發及細胞克隆性確證等。文件指出,細胞庫(Cell bank)的穩定性及純度是一個需要考慮的重要方面。非單克隆來源的細胞群中,其細胞異質性相對較高,產量低的細胞系往往與高產細胞群體競爭,導致高產細胞個體占比越來越少,最終隨著傳代次數的增加,導致細胞庫或工作庫的質量下降,因此,通過單克隆細胞篩選是提高病毒載體產量及質量的重要步驟。單克隆源性的確證是一種控制細胞種群降低其異質性的方法,通過防止異種細胞群體的產生,來保障未來生產出的病毒產品的質量不受影響。

CEVEC公司(CEVEC Pharmaceuticals)針對 ELEVECTA® AAV包裝細胞系的研究數據顯示,通過單克隆篩選出的細胞株其AAV產量要比非單克隆細胞來源的高10倍左右。

張瑰宜博士在“生物藥生產用細胞株構建和篩選策略”研討會上分享了她們使用Cytena 的單細胞打印機SCP的感受,其以噴墨式打印技術溫和而高效的分選單細胞,簡化篩選工作流程,極大的提高了單克隆有效率,獲得了穩定性高及一致性好的單克隆,用于后續的AAV生產,大大的提高了AAV產量。

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克隆HEK293細胞的記錄

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HEK293單克隆細胞提高AAV產量


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生物藥生產用細胞株構建和篩選策略

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英國葛蘭素史克(GlaxoSmithKline,GSK)藥物研究中心報告了一種如何快速獲得穩轉的293T細胞,生成慢病毒載體的方法:將編碼所有慢病毒載體成分的單個 DNA 結構體穩轉入293T細胞,單細胞打印機進行單克隆篩選,獲取遺傳學和功能穩定的適應懸浮培養的生產用293細胞系。由此產生的懸浮細胞系可生產出與瞬時轉染一樣高滴度的病毒,可以在一次性攪拌罐生物反應器中輕松放大,并且在后續細胞培養中遺傳和功能穩定。此方法將降低慢病毒載體的大規模生產成本,提升慢病毒載體在細胞治療中的應用價值。Chen Y H , Pallant C , Sampson C J , et al. Rapid lentiviral vector producer cell line generation using a single DNA construct[J]. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2020.)

在基因編輯領域,Stephan Riesenberg等學者進行細胞克隆基因型和靶基因拷貝數分析時使用 Cas9 核糖核蛋白和 DNA 供體電穿孔在 FRMD7 基因中編輯 409-B2 hiPSC,分別用(不用)2 M M3814 處理細胞 3 天后使用單細胞打印機(Cytena)對細胞進行單克隆化用于后續分析。文章中HEK293 和 K562 細胞的單克隆化也是通過使用單細胞打印機分選單細胞來獲得的。Stephan R ,  Manjusha C ,  Dominik M , et al. Simultaneous precise editing of multiple genes in human cells[J]. Nuclc Acids Research, 2019(19):19.)

Gross等采用f.sight™單細胞打印機,通過GFP報告基因,用于選擇和克隆CRISPR/Cas9編輯以敲除RANKL蛋白的間充質干細胞(MSC),以進一步增強MSCs在再生醫學中的治療能力。
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