臨床中，心力衰竭期間心律失常的發生是一個需要關注的問題。區域電梯度引發心律失常，細胞離子跨膜梯度是其起源。英國和意大利研究人員Michele Miragoli等研究了衰竭心臟心肌細胞的納米級機械敏感特性是否與異常電活動的啟動有關。通過納米吸管產生液力噴射，在肌膜特定位置形成凹痕，啟動胞內鈣釋放。發現健康細胞中鈣jinxian于局部區域，而衰竭心肌細胞中會傳播擴散。心力衰竭使膜逐漸變硬并使肌膜下線粒體位移。秋水仙素處理可通過硬化細胞、破壞微管、移動線粒體及引發鈣釋放來使健康細胞模擬衰竭。線粒體質子梯度的解偶聯可消除衰竭細胞和秋水仙素處理細胞中的鈣啟動。因此微管依賴的線粒體機械傳感因子微區的破壞，可能是心力衰竭時異常鈣釋放的一種機制。文章以“Microtubule-Dependent Mitochondria AlignmentRegulates Calcium Release in Response to Nanomechanical Stimulus in HeartMyocytes”為題發表于Cell Reports。

背景

       泵衰竭和心臟性猝死是臨床治療面臨的重要挑戰。心力衰竭時，機械敏感性的改變可引發電不穩定和心律失常。使用原位完整心臟、離體心臟和離體細胞制劑，對促心律失常的機械電傳導已經有了廣泛研究，但信號傳導及其啟動所需的初始亞細胞機制仍不明確。已知肌節中，除產力之外還有些肌節蛋白可提供機械傳感和/或信號功能，這些肌節或Z盤復合蛋白的突變會導致細胞內Ca2+應答異常。

       心力衰竭時，細胞骨架重塑，可能會干擾機械感覺的正常調控，而缺乏適當的機械反饋控制可能會促進心力衰竭發展。心力衰竭期間發生的結構重塑涉及細胞膜（T小管缺失）、閏盤以及膜下微域，如蘭尼堿受體（RyRs）和肌質網。已知心肌梗塞早期，胞內線粒體位置、纖維間線粒體排列發生改變，而線粒體及二分體的規則排列在興奮-收縮偶聯和細胞內鈣處理穩態中起著關鍵作用。關于線粒體重塑在機械電轉導誘導的心律失常中的可能作用，我們了解甚少。因此許多傳統技術無法選擇性地機械激活或研究單個肌膜微結構域內的線粒體參與情況。本研究采用掃描離子電導顯微鏡（SICM）和表面共焦SICM來解決細胞拓撲結構和線粒體定位問題。

        通過納米精度的SICM納米吸管施加壓力，研究心力衰竭時機械誘導鈣釋放的亞細胞機制（圖1）。健康心肌細胞中，以規則的Z-grooves為目標的水力噴射，可引發機械誘導的細胞內鈣釋放（MiCai）事件，且MiCai空間受限。在Z-grooves不規則的衰竭心肌細胞中，MiCai則會傳播至整個細胞。產生傳播性MiCai的可能性與線粒體紊亂程度，以及施力點膜順應性降低有關。排除機械敏感離子通道和肌動蛋白絲后，觀察到可通過破壞健康心肌細胞中負責維持肌膜下線粒體位置的微管來模擬MiCai傳播。線粒體質子梯度的解耦會消除MiCai傳播。似乎與線粒體相關的微管可能代表一個信號微區，可對肌膜機械刺激做出反應。研究表明在心力衰竭進展過程中，微管和線粒體紊亂在異常鈣釋放的啟動中起著關鍵作用，為非動作電位介導的細胞內鈣釋放提供了一種解釋機制。

結果

01-衰竭心肌細胞的結構與力學特性

       在心肌梗塞（MI）后不同時間點，使用SICM掃描正常和衰竭心肌細胞（主要來自代償性肥大，遠離瘢痕區域）的肌膜結構特征。根據拓撲圖像，將移液管定位于肌膜上200nm處定（嵴或Z-groove或無結構區域）（圖1A）。隨后施加局部20kPa的水力噴射2s。水力噴射凹陷面積（圖1B）在0.125 μm2范圍內。

圖1 實驗方案示意圖。(A)5 μmol/L Fluo-4 AM處理細胞，SICM掃描細胞表面。納米管置于嵴或groove上方，保持200 nm距離不變，施加水射流壓力。根據Clampfit 10.0 (Molecular Devices)設置采集光閘(1-5KHz采集共8s)和壓力泵(20kPa持續2s)。記錄Fluo-4熒光發射(顏色編碼的延時圖)、Z向壓電位移(膜壓痕)和機械誘導的鈣起始及傳播。右為壓力、Z向壓電位移和鈣瞬態讀數距離。(B)離體心肌細胞中，20 kPa水射流壓力2s后的擾動區域。移液管填充1mM熒光黃，得到約0.125μm2區域(綠點)，插圖為放大。

       以大鼠為模型研究心肌梗塞后發展為心力衰竭的心肌細胞，模型在16周出現心力衰竭，有明顯的肥厚及左心室衰竭。首先獲得正?；蛩ソ咝募〖毎?0×10μm大小的SICM拓撲圖像，用于量化表面結構規則性的破壞情況，可見肌膜規則性逐漸改變（圖2A）。測量心肌梗塞后16周的Z-groove指數，發現從對照心肌細胞的0.62±0.16顯著降低到0.44±0.19（圖2B）。因此心肌梗塞后，膜組織發生了實質性的改變，包括嵴（crests）和溝（grooves）的消失。

       為研究細胞表面微區的機械特性，在細胞光滑或溝區施加0-40kPa（通常20kPa）水力噴射2s，記錄移液管的垂直位移。移液管由SICM反饋控制機制驅動，隨細胞表面移動，記錄膜位移（Z向）與壓力做函數。發現正常細胞中，溝周圍區域比嵴處硬，施加相同壓力移液器位移更少，但衰竭的細胞哪個區域的膜都比較硬（圖2D）。

       心力衰竭發展期間，心肌梗塞后4周細胞表面規律性開始發生變化，但不明顯（圖2A和2C）。肌膜的膜順應性顯著減少（圖2D）。8周時結構逐漸喪失，肌膜比對照細胞更硬。水力噴射后的膜順應性數據計算彈性楊氏模量，發現整個肌細胞表面的模量變化很大（圖2D）。

圖2 向心力衰竭發展時，MiCai傳播從局部向整體變化。（A）左上為AMC心肌細胞表面；右上為心力衰竭細胞；左下為MI 8周的細胞；右下為MI 16周。（B）向心力衰竭發展期間MiCai傳播頻率。（C）Z-groove指數。（D）20kPa壓力施加2s后的膜順應性。

02-衰竭心肌細胞中的MiCai

       健康的對照心肌細胞中，施加于Z-groove的壓力啟動了局部MiCai，特征是擴散相對緩慢，并且空間上局限于壓力部位（圖3A左）。而在衰竭心肌細胞中，MiCai始于壓力部位并傳播擴散至整個細胞（圖3A右）。衰竭細胞中MiCai傳播更快（達到峰值的時間更短），對照心肌細胞主要表現為局部MiCai，達到峰值總時間為252.4±11ms，而衰竭心肌細胞主要為傳播性MiCai，到達峰值時間為134±26ms（圖3B）。研究MiCai的特征和動力學發現，衰竭細胞中的MiCai事件的持續時間比對照細胞長，且振幅更高（圖3B）。隨著心肌梗死后細胞重塑并向心力衰竭發展，MiCai傳播的概率和頻率增加。心肌梗塞后4周，傳播性MiCai的出現頻率只是略高于對照，而心肌梗塞后8周，液力噴射后傳播出現的頻率更高（圖2B）。

       通常衰竭的心肌細胞表現出兩種不同的MiCai起始和傳播模式。一重是出現一個孤立的“波紋”，從壓力點下方開始并逐漸傳播至整個細胞，發生在心肌梗塞后4、8和16周的所有時間點。另一種更為復雜，MiCai波從壓力點下方開始，但1或2ms后，會有一個或多個來自細胞外圍的遠程MiCai信號（二進制出現）跟隨初始波。隨后三重Ca2+波正面碰撞并快速傳播至整個細胞。

03-MiCai起始與L型鈣通道、肌漿網、拉伸激活通道或肌動蛋白細胞骨架無關

       從0到低（0.1μmol/L）再到“生理水平”（1.8μmol/L）改變胞外Ca2+濃度，發現不會影響MiCai頻率。nifedipine處理（抑制鈣內流）也未能阻止MiCai發生（圖3C左下）。Caffeine（RyR激動劑）處理發現，盡管高劑量Caffeine會使RyR2打開，但不會改變正常和衰竭細胞中已傳播MiCai的頻率（圖3C上）。其他可能觸發MiCai的機械因素方面，液力噴射會在細胞膜上形成凹痕并使膜發生拉伸，用100μmol/L streptomycin或30μmol/L釓（Gd3+）抑制拉伸激活通道，未能消除壓力部位下的MiCai起始，表明主要的局部機械傳感因子與拉伸激活通道無關。鑒于肌節與骨骼肌間costamere處的許多蛋白質是肌動蛋白結合的機械傳感蛋白質，因此用5μmol/L細胞松弛素D處理2h，破壞AMC細胞中的肌動蛋白微絲，使心肌細胞肌膜變硬并阻斷收縮，但也沒有改變MiCai事件的發生率或Z-groove比率。

圖3 向心力衰竭發展時，MiCai傳播從局部向整體變化。（A）AMC和MI后16周衰竭細胞的傳播時間圖。（B）AMC和衰竭細胞中機械誘導的鈣瞬變（MiCai）參數。（C）基線以及Caffeine、nifedipine、CCCP和CsA存在下，AMC細胞中的MiCai頻率。

04-心力衰竭期間線粒體的重排與觸發MiCai相關

       細胞外鈣參與的缺乏表明存在細胞內Ca2+源。已知線粒體參與壓力誘導的細胞內Ca2+釋放，因此采用共聚焦顯微鏡結合SICM和透射電子顯微鏡（TEM），研究衰竭細胞中二分體和線粒體之間的相互作用。在正常對照心肌細胞中，活躍的TMRM標記線粒體周期性排列與嵴對齊，反映出Z-grooves和T小管開口排列規則（圖4）。心力衰竭細胞中線粒體失去組織規律性，似乎也變長（圖4右），碎片變少，線粒體平均面積增加。分別用CCCP和環孢菌素A（CsA）抑制線粒體質子梯度和通透性轉換孔，發現消除了衰竭細胞中傳播的MiCai（圖3C右下）。表明線粒體在該過程中起著積極的作用。因此線粒體紊亂與MiCai傳播的發生相關，重塑線粒體微結構域在MiCai起始中可能起積極作用。

圖4 MI引發的二元微區重構以線粒體位移為特征。左列：對照AMC；右列：心衰細胞（MI后16周）。從上至下依次為：SICM表面拓撲圖像；TMRM標記線粒體；SICM細胞拓撲和表面共聚焦融合圖；心衰時線粒體重組的透射電子顯微圖。

05-微管網絡紊亂是線粒體位移的原因

       有研究發現微管參與MiCai和Ca2+i火花產生。用10μmol/L秋水仙素干擾微管聚合（圖5）。秋水仙素對表面Z-groove結構（Z-groove指數，處理前0.61±0.04，處理后0.63±0.05）或T小管密度都沒有影響。但秋水仙素和諾考達唑處理都使T小管規則性和膜順應性顯著降低。秋水仙素處理后的細胞，液力噴射對嵴施壓，會使69%細胞引發MiCai，而對照AMC細胞（沒有秋水仙素處理）中，這一比例為12%（圖5A）。然而秋水仙素加CCCP（圖5C）或秋水仙素加CsA組合處理都能夠*消除這種效應。共聚焦和TEM顯示對照組中，秋水仙素使肌膜下線粒體發生了位移（圖5B右），線粒體平均面積增加，類似心力衰竭細胞。即使在正常細胞中，秋水仙素也會使膜變硬（圖5D），并產生與心力衰竭時相似的膜順應性。表明微管網絡的失調使線粒體發生移動，這是MiCai易感的關鍵機制。

       已知β-tubulin在很大程度上與包括線粒體在內的細胞質細胞器共定位。因此在秋水仙素處理的細胞中研究線粒體移位及其重新定位與微管紊亂之間的關系。免疫細胞化學分析表明，秋水仙素顯著破壞了AMC細胞（圖5B）和心力衰竭細胞中的心肌細胞β-tubulin。已知心力衰竭細胞中微管蛋白網絡異常，qPCR對mRNA表達分析證實了α1A-tubulin（TUBA1A）、β2B-tubulin（TUB2B）、β3-tubulin（TUBB3）、γ-1 tubulin（TUBG1）和tubulin相關蛋白（MAP4）的表達總體增加。以上這些均與微管動力學的改變有關。*破壞衰竭心肌細胞的微管網絡（秋水仙素處理）并沒有消除MiCai，也不會顯著影響膜順應性。

圖5 破壞微管會導致MiCai發生頻率更高。（A）MiCai時間進程圖。上，20kPa沒有產生MiCai；下，10μmol/L秋水仙素36℃孵育1h，20kPa表現出MiCai傳播。（B）T小管（綠色）和β-tubulin（紅色）染色。最右電子顯微鏡圖片為10μmol/L秋水仙素孵育1h后AMC細胞中染色體移動。（C）不同處理下的MiCai傳播頻率。（D）秋水仙素和CCCP處理的AMC中嵴和溝處的膜順應性。

06-人衰竭DCM細胞中的MiCai

       利用擴張型心肌病（DCM）患者的心肌細胞研究人心肌細胞的MiCai發生率。SICM成像揭示了拓撲異質性（圖6A），與之前觀察到的衰竭大鼠心肌細胞類似。施加壓力后65%發生MiCai傳播（圖6B和6C），主要為壓力施加在非橫紋、較硬的區域時（圖6D），可模擬大鼠心力衰竭模型。與大鼠衰竭細胞類似，人DCM細胞中α1C-tubulin（TUBA1C）、β2A-tubulin（TUBB2A）、TUBB3、TUBG1和MAP4較非衰竭心肌細胞顯著上調，表明微管瓦解在細胞MiCai易感中起主要作用（圖6E）。

圖6 人DCM心肌細胞中MiCai的出現情況。（A）人心衰心肌細胞的膜。（B）MiCai傳播時間圖。（C）熒光示蹤MiCai。（D）人心衰細胞中傳播MiCai的頻率。（E）與非心衰心肌細胞相比，DCM心肌細胞中微管蛋白mRAN上調。

結論

       本研究結合SICM，描繪了單個細胞中機械引發的脈沖傳播，能夠以納米精度識別并定位活細胞（特別是心肌細胞）中的功能性機械感應。得到的數據表明，衰竭會改變肌膜拓撲結構和機械特性，破壞膜結構規律性、使順應性降低（變硬）。由心力衰竭衍生的心肌細胞中，由于細胞膜硬度較高、微管網絡異常，會將局部納米機械應力產生的局部性、線粒體依賴性的Ca2+釋放轉變為傳播性Ca2+釋放，從而啟動細胞范圍內的Ca2+波傳播。另外微管網絡破壞是MiCai傳播的先決條件，線粒體重排也與觸發MiCai有關，而LTCC和肌質網等鈣源與MiCai的產生無關。鑒于多細胞水平下的胞內Ca2+波可促進心律失常的發生，本文描述的機制可能解釋了部分異位起始和傳播引發心律失常的機制。不僅從機械方面加深了理解，也為臨床提供了新的治療靶點。此外，膜順應性的改變可能成為一個潛在的臨床標志，通過改變力的傳遞從而改變鈣含量。

參考文獻：

Miragoli,  M. , et al. "Microtubule-Dependent Mitochondria Alignment Regulates  Calcium Release in Response to Nanomechanical Stimulus in Heart  Myocytes." Cell Reports 14.1(2016):140-151.