單壁碳納米管（SWCNTs）因在近紅外（NIR）區域有穩定的光致發光特性而在生物成像領域應用頗多。單鏈DNA可以通過非共價鍵與SWCNTs結合（DNA-SWCNTs），使SWCNTs有更好的生物相容性。研究表明，SWCNTs進入人體之后，會被巨噬細胞“內化”，并在溶酶體定位。對SWCNTs的表面進行修飾，可以改變SWCNTs在細胞內的“命運”。但是，人們對DNA單鏈的長度如何影響DNA-SWCNTs在復雜細胞環境中的代謝知之甚少。

       2019年3月，美國羅德島大學Daniel Roxbury教授課題組在《Nano Letters》發表題為“Biomolecular Functionalization of a Nanomaterial To Control Stability and Retention within Live Cells”的文章，介紹了DNA-SWCNTs與細胞之間相互作用的關系。

DNA單鏈的長度與DNA-SWCNTs熒光強度的關系

       為了研究DNA單鏈的長度對DNA-SWCNTs光學特性的影響，作者先用五種單鏈DNA（(GT)n，n=6，9，12，15，30）對SWCNTs進行修飾，后與小鼠巨噬細胞一起培養30分鐘（(GT)n-SWCNTs濃度：1mg/L）。當用730 nm激光激發時，大多數細胞表現出明亮的寬頻發射（900-1600nm），說明DNA-CNTs被細胞“內化”。作者探究了熒光強度與DNA單鏈的長度和時間的關系，結果顯示，DNA-SWCNTs熒光強度與DNA單鏈長度成正比而與時間成反比。有趣的是，具有較長DNA單鏈的DNA-SWCNTs的初始的熒光強度分布較廣，說明長鏈DNA使DNA-SWCNTs對近紅外光更敏感。作者對細胞內DNA-SWCNTs的熒光強度進行了量化并計算了細胞內的平均熒光強度，發現細胞內的熒光強度隨著DNA鏈長的增加而增加，皮爾森相關系數分別為0.846、0.885和0.850，證實兩者線性相關且具有統計學意義（圖1）              


圖1：DNA-SWCNTs的熒光強度與DNA單鏈長度的關系；（a）(GT)15-SWCNTs的熒光圖像、白光圖像和整合的熒光/白光圖像；（b）DNA-SWCNTs的熒光圖像；（c）DNA-SWCNTs熒光強度柱形圖；（d）DNA-SWCNTs的平均熒光強度

DNA-SWCNTs熒光強度與DNA單鏈長度和SWCNTs手性的關系
       為了進一步比較SWCNTs手性與熒光穩定性的關系，作者將發射中心波長轉化為能量，并將DNA-CNTs的熒光強度與對照組做了對比。研究表明，5種DNA-SWCNTs中，只有(GT)6-SWCNTs熒光強度隨時間的延長而增加，其他4種DNA-SWCNTs的熒光強度有適度的損失。對于某一種手性的SWCNTs而言，(GT)n-SWCNTs熒光強度損失沒有在同一時間段內發生，說明熒光強度的損失是多種因素的結果。為了在單細胞水平上研究光譜位移，作者利用高光譜技術繪制了(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的高光譜圖像，并將高光譜圖像中每一個包含SWCNTs像素點擬合到洛倫茲曲線上，用(94)-SWCNTs的中心輻射能量圖覆蓋白光圖，并為每個圖像構建直方圖以描述細胞內SWCNTs發射能量的變化。作者發現，0h的時候，(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的熒光強度在統計意義上*相同。將直方圖進行高斯擬合，可以通過半全寬來評估總體的異質性。研究表明，內化后(GT)6-SWCNTs的半高寬是(GT)30-SWCNTs的兩倍，且(GT)30-SWCNTs的輻射強度不隨時間變化。6 h后，(GT)6-SWCNTs的發射能量降低了8 meV，半高寬降低了50%。作者認為，這種近紅外光熒光強度的變化是DNA-SWCNTs復合物的DNA單鏈末端相對豐度變化的結果，對于DNA-SWCNTs中一定質量的DNA，(GT)6-SWCNTs中DNA單鏈數是(GT)30-SWCNTs的5倍（圖2）。

圖2：熒光強度與DNA單鏈的長度和SWCNTs手性的關系；（a）細胞內熒光強度的熱圖；（b）(GT)6-SWCNTs和（c）(GT)30-SWCNTs的白光圖和高光譜圖像的疊加圖和熒光能量分布直方圖

細胞內DNA-SWCNTs熒光強度的穩定性
       被細胞內化的DNA-SWCNTs的光譜穩定性有較大差異。作者基于SWCNTs對常規有機熒光團的淬滅效應，設計了一種檢驗DNA-CNTs完整性的方法。實驗人員首先用Cy3對(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs進行標記，脫氧膽酸鈉（SDC）小分子通過競爭機制取代Cy3-DNA附著在SWCNTs的表面，使原來發生熒光淬滅效應的SWCNTs重新發出明亮的熒光。盡管SDC的置換動力學不相同，但Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的熒光淬滅動力學是相似的。當用含有Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的細胞培養物培養巨噬細胞時，Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的熒光淬滅現象有很大的不同，Cy3-(GT)6-SWCNTs很快的發生熒光淬滅并在4 h達到maximum熒光強度，24h后降至初始熒光強度；相比之下，Cy3-(GT)6-SWCNTs則在任何時間段均未觀察到熒光淬滅現象（圖3）。

圖3：DNA-SWCNTs在細胞內的穩定性；（a）實驗設計示意圖：SWCTNs被DNA單鏈緊密包裹時，未發生熒光淬滅現象，DNA單鏈解離時發出強烈熒光；（b）熒光強度隨SDC小分子置換時間的增加而增加；（c）用Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs培養的RAW 264.7細胞的白光圖和熒光圖的疊加；（d）平均熒光強度直方圖

細胞對DNA-SWCNTs的“內化”和“外排”
       盡管SWCNTs的熒光強度受到濃度和局部環境的影響，但是SWCNTs的某些特征只和濃度有關，這就意味著，無論樣本的熒光強度如何，SWCNTs的手性信息在拉曼圖譜中都可以被表達出來。作者使用共聚焦拉曼顯微鏡評估了SWCNTs在細胞內的局部濃度，首先使用1mg/L的Cy3-(GT)6-SWCNTs或Cy3-(GT)30-SWCNTs培養巨噬細胞30分鐘，對0.5μm的微小區域進行拉曼成像。為了計算出每個細胞內SWCNTs的質量，作者得出了G峰與SWCNTs濃度的特征曲線。Cy3-(GT)6-SWCNTs培養的巨噬細胞中SWCNTs的起始濃度是Cy3-(GT)30-SWCNTs培養的巨噬細胞的兩倍；24 h后，Cy3-(GT)6-SWCNTs培育的巨噬細胞內SWCNTs的濃度下降了75%，而Cy3-(GT)30-SWCNTs培育的巨噬細胞內SWCNTs的濃度下降較小。作者將Cy3-(GT)6-SWCNTs培育的巨噬細胞內SWCNTs的起始濃度高的原因歸結于單根SWCNTs上的DNA密度較大，這增加了細胞膜蛋白與DNA相互接觸的概率；相反，也正是由于膜蛋白與DNA接觸概率的增大，從而使得巨噬細胞可以更快的以胞吐的形式“釋放”SWCNTs。

       為了更好的理解胞吐機制，作者對細胞“釋放”(GT)6-SWCNTs的途徑進行了探究。作者設計了一個實驗，用巴弗洛霉素A1和諾考達唑（兩種抑制細胞溶酶體胞吐作用的化學藥物）對巨噬細胞進行了處理，并比較細胞內DNA-SWCNTs的濃度。結果顯示，(GT)6-SWCNTs在細胞內的濃度高于對照組，(GT)30-SWCNTs的濃度與對照組相比變化不大；相反，用布雷非德菌素A和Exo1（兩種抑制高爾基體分泌的化學藥物）對巨噬細胞進行處理，結果顯示，(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的濃度與對照組相比差異性較小；這說明細胞主要是通過溶酶體的胞吐作用來實現DNA-CNTs的“釋放”（圖4和圖5）。

圖4：通過共聚焦顯微鏡確定SWCNTs的濃度；（a）Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs培養的RAW 264.7細胞的G峰強度圖和白光圖（b）從細胞中ROI區域像素點計算得出的SWCNTs的濃度；（c）被細胞內化的SWCNTs的比值；（d）細胞上清液中外源性SWCNTs的濃度；（e）共聚焦拉曼光譜G峰強度圖與白光圖的疊加；（f）在（e）圖中包含SWCNTs的所有像素點的平均濃度

       溶酶體胞吐的主要功能之一是分泌各種生物大分子，如蛋白質、酶和抗原，以進行細胞之間的信息傳遞，也可使周圍細胞產生免疫反應。有研究表明，對SWCNTs的表面進行修飾可以有效降低對細胞的毒性，原始的SWCNTs與細胞膜上的受體相互作用之后會被認為是一個有害物質。因此，作者認為溶酶體將DNA鏈段從DNA-SWCNTs復合物上去除后，會使得細胞將“裸露”的SWCNTs當做異物，而引發細胞的胞吐作用將其排出，導致細胞內SWCNTs的濃度降低；而長鏈的DNA對SWCNTs的包覆比較嚴密，溶酶體無法將DNA-SWCNTs復合物上的DNA“剔除”，從而無法產生胞吐作用，這會導致(GT)30-SWCNTs在細胞內的滯留。

圖5：DNA長度相關性的細胞內加工示意圖；（a）巨噬細胞將(GT)6-SWCNTs復合物內化并在溶酶體內定位，隨后生物分子與DNA鏈發生交換，并迅速誘導溶酶體胞吐；（b）巨噬細胞將(GT)30-SWCNTs復合物內化并在溶酶體內定位，而DNA-SWCNTs的完整性使SWCNTs被長時間保留在細胞內

總結：

       作者借助于可見-近紅外高光譜成像和共聚焦拉曼顯微技術，發現DNA單鏈的長度對DNA-SWCNTs的光學穩定性有影響，通過調節DNA單鏈的長度可以實現對細胞“攝入”和“外排”SWCNTs的調節；DNA-CNTs上較短的DNA單鏈在溶酶體內被細胞的生物小分子取代，改變了SWCNTs的物理特性和在細胞內的“命運”；最后通過藥物實驗證實了細胞對SWCNTs的“外排”是通過胞吐作用。這些發現有助于人們進一步理解SWCNTs與細胞之間的相互作用，也為后續科研人員進一步探究細胞對官能化小分子的“響應性”奠定了理論基礎。

參考文獻
[1] Gravely M, Safaee M M, Roxbury D.Biomolecular Functionalization of a Nanomaterial To Control Stability andRetention within Live Cells[J]. Nano Letters, 2019, 19(9) 6203-6212.