微波增強的多肽固相合成（SPPS）可以合成具有對稱賴氨酸分支的多抗原肽（MAPs）或多肽樹枝狀大分子，合成時間大幅降低，純度提高。四分支酰基載體蛋白（ACP）肽的合成在2小時內(nèi)完成，純度為70%。四分支M10肽¹（巴西副球孢子菌糖蛋白T細胞表位）的合成在4小時內(nèi)完成，純度為50%。在2小時內(nèi)合成純度為80%的一個八聚體，第三代賴氨酸-亮氨suan抗菌肽樹枝狀大分子（G3KL）²。

引言

對稱分支肽（圖1）代表一類具有非常理想的理化和生物學特性的肽。在一些情況下，由于與蛋白質(zhì)靶標的多價結(jié)合或具有更高的蛋白酶抗性，包含分支核心的肽，如多抗原肽（MAPs）或肽樹狀聚合物有更高的生物活性³。因此分支肽已被用于各種治療應用，包括開發(fā)抗微生物和抗病du藥物^4,5、腫瘤靶向劑^6,7和藥物輸送載體⁸。

對稱分支肽的合成可通過在SPPS中使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH來生成支鏈位置。合成通常比較困難，因為在分支支架上肽鏈固有的緊密接近性，會導致空間沖突和肽偶聯(lián)不良。將微波能量應用于分支肽的合成克服了這些空間挑戰(zhàn)，允許更有效的偶聯(lián)和快速合成較少缺失的困難分支肽產(chǎn)物 (CarboMAXTM)。⁹

材料和方法

試劑

以下含有特定側(cè)鏈保護基團的Fmoc氨基酸購自CEM公司(Matthews, NC)：Arg(Pbf)、Asn (Trt)、Asp (OtBu)、Gln(Trt)、His (Boc)、Lys (Boc)、Tyr (tBu) 和Thr (tBu)。Rink Amide ProTide LL 樹脂也得自CEM 公司。Fmoc-6-Ahx-OH 購自AnaSpec (Fremont, CA)。Fmoc-Lys(Fmoc)OH 獲自 CreoSalus (Louisville, KY)。N,N'二異丙基碳二亞胺(DIC)、哌啶、三fu乙suan(TFA)、3,6-二氧六環(huán)-1,8-辛二硫醇(DODT) 和三異丙基硅烷(TIS) 購自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無水乙mi(Et2O)、乙酸、HPLC 級水和乙腈購自VWR (West Chester, PA)。LC-MS 級水(H2O) 和LC-MS 級 乙 腈 (MeCN) 購 自 Fisher Scientific (Waltham, MA)。

多肽合成：四分支ACP, (VQAAIDYING)4-(K)2-K-Ahx-KK-NH2

使用CEM Liberty BlueTM 自動微波肽合成儀在Rink Amide ProTide LL 樹脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上以0.1 mmol 規(guī)模（樹脂規(guī)模：0.025 mmol）制備肽（下圖）。用哌啶和Oxyma Pure 在DMF 中進行脫保護。在 DMF (CarboMAX) ⁹中，五倍過量的Fmoc-AA 與DIC 和Oxyma Pure 進行偶聯(lián)反應。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用帶有 TFA/H2O/ TIS/DODT 的CEM RazorTM 高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。切割后，用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。

Tetra-branched ACP

多肽合成: 四分支M10, (LIAIHTLAIRYAN)4-(K)2-K-Ahx-KK- NH2

使 用 CEM Liberty BlueTM 自 動 微 波 肽 合 成 儀 在 Rink Amide ProTide LL 樹 脂（離 子 交 換 容 量 ：0.19 meq/g）上 以 0.1 mmol 規(guī)模（樹脂規(guī)模：0.025 mmol）制備肽（下圖）。用哌啶和 Oxyma Pure 在DMF 中進行脫保護。在 DMF 中 5 倍過量的Fmoc-AA 與DIC 和Oxyma Pure 進行偶聯(lián)反應( CarboMAX)⁹。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用帶有 TFA/H2O/TIS/DODT 的CEM RazorTM 高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，用無水乙mi沉淀肽并過夜凍干。

Tetra-branched M10

多肽合成：G3KL 八聚體, (KL)8-(KKL)4-(KKL)2-KKL-Ah-KK-NH2

使 用 CEM Liberty Blue 自 動 微 波 肽 合 成 儀 在 Rink Amide ProTide LL 樹脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上以0.25 mmol 規(guī)模（樹脂規(guī)模：0.025 mmol）制備肽（下圖）。用哌啶和Oxyma Pure 在DMF 中進行脫保護。在 DMF 中5倍過量的 Fmoc-AA 與DIC 和Oxyma Pure 進行偶聯(lián)反應(CarboMAX)⁹。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用具有TFA/H2O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。

G3KL Octamer

多肽分析

在配備有 PDA 檢測器的 Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)上分析肽，該 檢 測 器 配 備 Acquity UPLC BEH C8 柱（1.7mm 和2.1×100mm）。UPLC 系統(tǒng)連接到Waters 3100 Single Quad MS 用于結(jié)構測定。在 Waters MassLynx 軟件上進行峰值分析。在 (i)H2O 和 (ii)MeCN 中以0.05% TFA的梯度洗脫進行分離。

結(jié)果

圖4 ：G3KL八聚體的UPLC色譜圖

結(jié)論

與傳統(tǒng)的 SPPS 方法相比，使用微波增強的 SPPS 可以更快地制備對稱分支肽，并且純度更高。使用微波增強 SPPS，在2小時內(nèi)合成了純度為 70% 的四分支 ACP。四支化 M10 肽的常規(guī)室溫合成需要超過42小時的手工勞動，目標肽的分離產(chǎn)率為 4%。

另一方面，微波增強的 SPPS 可在4小時內(nèi)提供純度為50%。G3KL 八聚體的常規(guī)合成需要超過35小時的手工勞動時間，并以 8% 的分離產(chǎn)率產(chǎn)生目標肽。² 將微波能量應用于 G3KL 八聚體的合成可在2小時內(nèi)以 80% 的純度提供目標肽 。

參考文獻

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