紫外分析儀檢測食品中的黃曲霉**

來源：上海嘉鵬科技有限公司 2022年05月04日 09:04

ICS 67.050
X 04
中華人民共和標準
GB/T 18979-2003
食品中黃曲霉**的測定
**親和層析凈化效液相色譜法
和熒光光度法
De te r m in at io n a fla to xins content
Cleanup by immunoaffinity chromatogaphy
in foodand
determination by
high-performance liquid chromatigraphy and fluorometer
2003-02-21發布2003-08-01實施
雄宙嘉 k Wi A * 1 M 發布
GB/T 18979-2003
月明青
本標準由北京市提出。
本標準由全食品工業標準化技術委員會歸口。
本標準起草單位:北京市產品質量監督檢驗所、青島出人境檢驗、標準物質研究中心。
本標準主要起草人:晶、張鵬、張藝兵、邵明武。
本標準為次發布。
GB/T 18979-2003
食品中黃曲霉**的測定
**親和層析凈化效液相色譜法
和熒光光度法
范圍
本標準規定了**親和層析凈化效液相色譜法和**親和層析凈化熒光光度法測定食品中
黃曲霉**的條件和詳細分析步驟。
本標準適用于玉米、花生及其制品(花生醬、花生仁、花生米)、大米、小麥、植物油脂、醬油、食醋等食
品中黃曲霉**的測定。
樣品中黃曲霉**的檢出限:**親和層析凈化效液相色譜法測定黃曲霉**B;以及黃曲霉
**B,,玖,G,,G 。總量檢出限為 1k g/kg。**親和層析凈化熒光光度法測定黃曲霉**B氏、
G,,G 總量檢出限為 1m g/kg,醬油樣品中檢出限為2.5 p g/kg.
2 **親和層析凈化效液相色譜法
2.1 方法提要
試樣經過甲醇水提取，提取液經過濾、稀釋后，濾液經過含有黃曲霉**特異抗體的**親和層析
凈化，此抗體對黃曲霉**BBz,GG:具有專性，黃曲霉**交聯在層析介質中的抗體上。用水
或吐溫-20/PBS將**親和柱上雜質除去，以甲醇通過**親和層析柱洗脫，洗脫液通過帶熒光檢測器
的效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測定黃曲霉**的含量。
2.2 試劑和溶液
除非另有規定，僅使用分析純試劑、重蒸餾水。
2.2.1 甲醇(CH,OH):色譜純。
2.2.2 甲醇水(7+3):取70 mL甲醇加30 mL水。
2.2.3 甲醇水(8+2):取80 mL甲醇加20 mL水。
2.2.4 甲醇水(45+55):取45 mL甲醇加55 mL水。
2.2.5 苯:色譜純。
2.2.6 乙睛:色譜純。
2.2.7 苯乙睛(98+2):取2 mL乙睛加98 mL苯。
2.2.8 抓化鈉(NaCI),
2.2.9 磷酸氫鈉(NaiH PO,),
2.2. 10 磷酸氫鉀(KHzP04).
2.2. 11 (KCl) e
2.2 .1 2 PBS緩沖溶液:稱取 8.0 g氯化鈉，1.2 g磷酸氫鈉，0.2 g 磷酸氫鉀，0.2 g 抓化鉀，用
990 mL純水溶解，然后用濃鹽酸調節pH值至7.0，后用純水稀釋至1 000 ML.
2.2.1 3 吐溫-20/PBS溶液(0.1 00):取 1m l吐溫-20，加人 PBS緩沖溶液并定容至 10 00m L,
2.2.1 4 pH7.0磷酸鹽緩沖溶液:取 25.0 m L 0.2 m ol/L的磷酸氫鉀溶液與 29.1 m L 0.1 m ol/L的
氫氧化鈉溶液混勻后，稀釋到100 mL.
GB/T 18979- 2003
2.2. 15 黃曲霉**標準品(黃曲霉**BB2,GG):純度)9900
2-2. 16 黃曲霉**標準儲備溶液:用苯乙睛(98+2)溶液分別配制。. 100 mg/mL的黃曲霉**B, ,
B2,G,,G:標準儲備液，保存于4℃備用。
2.2. 17 黃曲霉**混合標準工作液:準確移取適量的黃曲霉**BB 2,G G:標準儲備液，用苯乙
睛(98+2)溶液稀釋成混合標準工作液。
2.2. 18 柱后衍生溶液(0.05%碘溶液):稱取。. 1 g碘，溶解于20 mL甲醇后，加純水定容至200 mL,
以0. 45 jam的尼龍濾膜過濾,4℃避光保存。
2.3 儀器和設備
實驗室常規儀器、設備及下列各項。
2.3. 1 速均質器:18 000 r/min-22 000 r/mine
2.3.2 黃曲霉****親和柱。
2.3.3 玻璃纖維濾紙:直徑11 cm，孔徑1. 5 pme
2.3.4 玻璃注射器:10 mL,20 mLa
2.3.5 玻璃試管:直徑12 mm，長75 mm，無熒光特性。
2.3.6 效液相色譜儀:具有360 nm激發波長和大于420 nm發射波長的熒光檢測器。
2.3.7 空氣壓力泵。
2.3.8 微量注射器:100 KLe
2.3.9 色譜柱:C,，柱(柱長150 mm，內徑4.6 mm，填料直徑5 pm) e
2.4 分析步驟
2.4. 1 提取
2.4.1.1 大米、玉米、小麥、花生及其制品:準確稱取經過磨細(粒度小于2 mm)的試樣25. 0 g于
250 mL具塞錐形瓶中，加人5. 0 g氯化鈉及甲醇水(7+3)至125.0 mL(V,)，以均質器速攪拌提取
2 min。定量濾紙過濾，準確移取15.0 mL(V2)濾液并加人30.0 mL(V,)水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾
1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1 .2 植物油脂:準確稱取試樣 25.0 g 于 250m L具塞錐形瓶中，加人 5.0 g 氯化鈉及加人甲醇水
(7+3)至 125.0m L(V,)，以均質器速攪拌提取 2m in。定量濾紙過濾，準確移取 15.0 M l-(V2)濾液
并加人30. 0 mL(磯)水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1.3 醬油:準確稱取試樣 50.0 g 于 250.0 mL具塞錐形瓶中，加人 2.5 g氯化鈉及加人甲醇水
(8十2)至100.0 mL(V4)，以均質器速攪拌提取1 mine定量濾紙過濾，準確移取10. 0 mL(V )濾液
并加人40.0 mL(V,)水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1.4 食醋:準確稱取 5.0 g 樣品，加人 1.0 g 氯化鈉，以pH7.0 磷酸鹽緩沖溶液稀釋至 25.0 m L
(V,),混勻，定量濾紙過濾。取 10.0 nt L(磯)濾液加人 10.0m L(認 )緩沖液，混勻，以玻璃纖維濾紙過
濾1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.2 凈化
2.4.2. 1 大米、玉米、小麥、花生及其制品、植物油脂:將**親和柱連接于20. 0 ml玻璃注射器下。
準確移取15.0 mL(V4)樣品提取液注人玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使
溶液以約6 mI./min流速緩慢通過**親和柱，直至2 mL-3 mL空氣通過柱體。以10 mL水淋洗柱
子兩次，棄去全部流出液，并使2 mL-3 mL空氣通過柱體。準確加人1.0 mL(V)色譜甲醇洗脫，流
速為1 mL/min-2 mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
2.4.2.2 醬油:將**親和柱連接于 10.0 m L玻璃注射器下。準確移取 10.0 mL(叭)醬油樣品提取
液注人玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約6 ml-/min流速緩慢通過
**親和柱。用10 mL 0. 1腸的吐溫20/PBS清洗，再以10 m1_水清洗柱子兩次，棄去全部流出液，并
使2 mL-3 mL空氣通過柱體。準確加人1.0 mL<V)色譜甲醇洗脫，流速為1 mL/min-2 mL/min,
GB/T 18979-2003
收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
2.4.2.3 食醋:將**親和柱連接于 10.0 m L玻璃注射器下。準確移取 10.0 mL(V,)食醋樣品提取
液注人玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約6 ml-/min流速緩慢通過
**親和柱，用10 mL 0. 1寫的吐溫-20/PBS溶液清洗，再以10 mL水清洗柱子兩次，棄去全部流出液，
并使2 mL-3 mL空氣通過柱體。準確加入1.0 mL(V)色譜甲醇洗脫，流速為1 mL/min-
2 mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
2.4.3 測定
2.4.3. 1 效液相色譜條件
流動相 :甲醇水(45+55)
流速 : 。 8M L/min
柱后衍生化系統
衍生溶液:。.05%碘溶液
衍生溶液流速:0.2 m L/min
反應管溫度:700C
反應時間:1m in
2.4.3.2 定量
用進樣器吸取100p L黃曲霉**混合標準工作液(2.2.17)注人效液相色譜儀，在上述色譜條件
下測定標準溶液的響應值(峰或峰面積)，得到黃曲霉**BB2,G,,G:標準溶液效液相色譜圖。
參考譜圖見圖1.
面暇肆憐粗權
卜權盼姍目權八
。妞贊甘扭權八n曰曰
翻。暇麟崢祖枉
41Fka20
招16 14 招10 8
保留時間/min
圖 1 B, ,B 2, G G 2 的標準譜圖
取樣品洗脫液 1.0 m L加人重蒸餾水定容至 2.0 m L，用進樣器吸取 100p L注人效液相色譜儀，
在上述色譜條件下測定試樣的響應值(峰或峰面積)。經過與黃曲霉**標準溶液譜圖比較響應值得
到試樣中黃曲霉** B,、 B2 ,G ,和G:的濃度 :。
2.4.4 空白試驗
用水代替試樣，按 2.4.1-2.4.3步驟做空白試驗。
2.4.5 結果計算
樣品中黃曲霉** BB2,G 1或 G:的含量(X,)以微克每千克表示，按式(1)計算:
(c:ca )·V
W
(1)
GB/T 18979- 2003
其中:
w署X(v 開3)XV 4 ，....... . 。.·....···. . (2)
式中:
X,— 樣品中黃曲霉**B, ,氏,G，或G:的含量，單位為微克每千克伽g/kg);
c,— 試樣中黃曲霉**BB,,G，或G:的含量，單位為微克每升(pg/L) ;
‘。— 空白試驗黃曲霉**BB2,G，或G:的含量，單位為微克每升(f'g/L );
V— 終甲醇洗脫液體積，單位為毫升(mL) ;
W— 終凈化洗脫液所含的試樣質量，單位為克〔9);
，— 試樣稱取的質量的數值，單位為克(g);
V,— 樣品和提取液總體積，單位為毫升(mL) ;
V2 稀釋用樣品濾液體積，單位為毫升(mL) ;
V3 稀釋液體積，單位為毫升(mL) ;
叭通過親和柱的樣品提取液體積，單位為毫升(mL) ,
黃曲霉**總量為BB2,G,,G2的濃度之和，即B,+ B2+ G,+ G2,
計算結果表示到小數點后兩位。
**親和層析凈化熒光光度法
3.1 方法提要
試樣經過甲醇水提取，提取液經過濾、稀釋后，濾液經過含有黃曲霉**特異抗體的**親和層析
凈化，此抗體對黃曲霉** B B2, G G:具有專性，黃曲霉**交聯在層析介質中的抗體上。用水
將**親和柱上雜質除去.以甲醇通過**親和層析柱洗脫，加人澳溶液衍生，以提測定靈敏度。洗
脫液通過熒光光度計測定黃曲霉**(B,+ 玖+G,十G2)總量。
3.2 試劑和溶液
除非另有規定，僅使用分析純試劑、重蒸餾水
3.2.1 甲醇(CH30H):色譜純。
3.2.2 甲醇水(7+3):取70 mL甲醇加30 mL水。
3.2.3 甲醉水(8+2):取80 mL甲醇加20 mL水。
3.2.4 抓化鈉(NaCD,
3.2.5 磷酸氫鈉(NatH PO,) 。
3.2.6 磷酸氫鉀(KH2P O,)o
12. 7 (KCl)
3.2.8 澳溶液儲備液(0.0 1%):稱取適量澳，溶于水，配成 0.01%的儲備液，40C避光保存。
3.2.9 澳溶液工作液(0.002寫):取 10m L0 .0 1%的澳溶液加人 40m L水混勻，于棕色瓶中保存備用。
需每次使用前配制。
3.2.1 0 水硫酸奎寧(C,oH z,N zO z·H2SO4，2Hz0),
3.2.1 1 硫酸溶液(0.0 5m ot/L):取 2.8 m L濃硫酸，緩慢加人適量水中，冷卻后定容至 10 00m L.
3.2.12 熒光光度計校準溶液:稱取3.40 g 硫酸奎寧(CzoH z,N ,0 2·HzS04·2H20)用0.0 5m ot/L硫
酸溶液稀釋至100 mL，此溶液熒光光度計讀數相當于20 has/L黃曲霉**標準溶液。
3. 3 儀器和設備
實驗室常規儀器、設備及下列各項。
3.3. 1 熒光光度計。
3.3.2 諫均質器.18 000 r/min--22 000 r/min
GB/T 18979-2003
3.3.3 黃曲霉毒索**親和柱。
3.3.4 玻璃纖維濾紙:直徑11 cm，孔徑1.5 [am.
3.3.5 玻璃注射器:10 mL,20 mI。
3.3.6 玻璃試管:直徑12 mm，長75 mm，無熒光特性。
3.3.7 空氣壓力泵。
3，4 分析步驟
3.4. 1 提取
同 2.4 .1 ,
3.4.2 凈化
同 2. 4. 2,
3.4.3 測定
3.4.3. 1 熒光光度計校準
在激發波長 360r an，發射波長450n 條件下，以。.05m ol/L硫酸溶液為空白，調節熒光光度計的
讀數值為。.。Fag/L;以熒光光度計校準溶液(3.2.12)調節熒光光度計的讀數值為 20.0 F ag/L,
3.4.3.2 樣液測定
取上述凈化后的甲醇洗脫液加人1.0 m L0 .0 020 o澳溶液，混勻，靜置1m in，按3.4.3.1條件進行
操作，于熒光光度計中讀取樣液中黃曲霉**(B,+ B2+ G,+ G2)的濃度。(Kg/L)e
3.4.4 空白試驗
用水代替試樣，按 3.4.1--3.4 .3 步驟做空白試驗。
3.4.5 結果計算
樣品中黃曲霉**(B,+ B2+ G,+ G2)的含量(X2)以微克每千克表示，按式(3)計算 :
(c:CD )·V
W
(3 )
其中:
WV,X V 2
(V2 + V,)
X V, (4)
式中:
X2— 樣品中黃曲霉**(B, +殘十G 十G2)含量，單位為微克每千克伽g/kg),
c2— 試樣中黃曲霉**(B，十Bz +G,十G )的含量，單位為微克每升(FHB/L) ;
‘。— 空白試驗黃曲霉**(B,+ B2+ G,+ G2)的含量，單位為微克每升恤B/L);
V— 終甲醇洗脫液體積，單位為毫升(mL) ;
W— 終凈化洗脫液所含的試樣質量，單位為克(9);
。— 試樣稱取的質量的數值，單位為克(9);
V,— 樣品和提取液總體積，單位為毫升(ML) ;
V— 稀釋用樣品濾液體積，單位為毫升(mL) ;
V 稀釋液體積，單位為毫升(mL);
V,— 通過親和柱的樣品提取液體積，單位為毫升(mL) o

計算結果表示到小數點后位。

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