激 素 性 股 骨 頭 缺 血 性 壞 死（steroid induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是由 于糖皮質激素大量使用導致骨內循環障礙、骨代 謝失衡、破骨細胞增多而成骨細胞凋亡，破壞股 骨頭局部血運，引起缺血、壞死，繼而導致股骨 頭塌陷、骨折的一種骨疾病。近年來，由于糖皮 質激素在臨床治療中的濫用，SANFH的發病率日 漸增高，占非創傷性股骨頭壞死的，起病隱 襲，病情發展較快，致殘性強，已成為困擾醫患 的重大公共難題之一 。本院院內制劑川骨片對 SANFH有顯著臨床療效，但其機制尚不明確。分 裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一類*/* 激酶，對細胞的生長、分化、炎癥反應等具有調節作用。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物

清潔級健康雄性日本大耳兔 56 只，體質量2.0～2.5 kg，由成都中醫藥大學實驗中 心提供（許可證號：川實動管第99011號），檢疫合格備用。本研究動物飼養及動物實驗均在成都中醫藥大學實驗中心完成，室內保持恒定溫度及濕 度，相對濕度為45%～60%。

1. 2 實驗藥物及制備

川骨片，由續斷、骨碎 補、黃芪、淫羊藿、肉蓯蓉、熟地、丹參、菟絲 子、枸杞、補骨脂、杜仲、當歸、牛膝、乳香、 沒藥、紅花、獨活、威靈仙、白術、茯苓、甘草 等組成，由成都中醫藥大學附屬醫院生產，批準 文號：川藥制字 Z。*膠囊（貴州 同濟堂制藥有限公司，批準文號：國藥準字 Z），主要由淫羊藿、續斷、丹參、知 母、補骨脂、地黃等組成，研究已證明本品能抑 制破骨細胞的吸收活動，加快骨再建活動，刺激 骨形成，提高骨密度，是臨床上用于股骨頭壞死 治療的有效制劑，本實驗中作為陽性對照藥物進行 研究。將川骨片（規格：0.3 g/片）使用蒸餾水熬制 為水劑，制備為生藥量0.6 g/mL混懸液體。將仙靈 骨葆膠囊（規格：0.5 g/粒）用蒸餾水熬制為水劑， 制備為含成藥*膠囊0.6 g/mL 的混懸藥液。 藥液均于0 ~ 4 ℃保存備用。以上藥液制備委托成 都中醫藥大學附屬醫院制藥車間完成。醋酸潑尼 松龍（華中藥業股份有限公司，規格：5 mL∶0.125 g， 生產批號：）。

1. 3 主要試劑與儀器

p-ERK1/2、p-JNK 和 p-p38 抗體（美國 CST 公司）； GAPDH（武漢普健生物公司）。BCA蛋白定量檢測試劑盒、RIPA lysis buffer （上海碧云天公司）；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰 胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒（武漢普健生物公 司）； 蛋 白 預 染 marker（美 國 Thermo Scientific公司）。TVO.63XC-MO HE染色成像系統 （廣州明美公司）；PP1152電泳儀（上海CAVOY 公 司）；EPS600C 電轉儀（上海天能公司）；TS-8S 脫色搖床（江蘇其林貝爾公司）；ChemiDocTM XRS+凝 膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；PerkinElmer全功 能微孔板檢測儀（美國PerkinElmer公司）。

1. 4 分組與造模

將56只雄性大耳兔隨機分成2 組，即空白組（16只）和造模組（40只）。適應性喂 養1周后，造模組采用賀西京造模法復制SANFH模 型：于兔右側臀部肌肉注射醋酸*龍8 mg/kg， 每周2次，連續注射6周。空白組右側臀肌注射等 量生理鹽水，每周2次，連續注射6周。所有動物 左側臀肌預防性注射*8萬U/kg，預防感染， 每周2次，共6周。6周后處死空白組4只和模型組 4 只進行模型鑒定。在無菌條件下取出右側股骨 頭，采用蘇木素—伊紅（HE）染色，于光鏡下觀察 骨小梁、骨細胞、髓腔及造血細胞形態、結構和 數量的變化，并在股骨頭軟骨下區骨組織上隨機 選擇10個高倍視野，計算每個視野中所有骨陷窩 數和空骨陷窩數，計算出空骨陷窩率，判斷造模 是否成功。空骨陷窩率=空骨陷窩數/全部骨陷窩 數 × 100%。

1. 5 給藥方法

造模成功后剩余的36只造模組兔 再隨機分為模型對照組、川骨片治療組、仙靈骨 葆膠囊治療組，每組12只。按成人60 kg體質量換 算法換算，川骨片治療組給予川骨片（劑量為0.6 g·kg-1 ·d-1 ）灌胃，*膠囊治療組給予仙靈骨 葆膠囊（劑量為0.6 g·kg-1 ·d-1 ）灌胃，模型對照組給 予蒸餾水1 mL/kg灌胃，空白組不做任何處理，連 續灌胃42 d。

1. 6 觀察指標與方法

1. 6. 1 取材

采用空氣栓塞法處死各組家兔，在 無菌條件下取出家兔右側股骨，取下股骨頭冠狀 面剖開分別置于 40 g/L 多聚甲醛、液氮中保存備 用。

1. 6. 2 光鏡觀察股骨頭組織形態

將組織放入配 好的混合酸脫鈣液中進行脫鈣，脫水機內依次梯 度酒精進行脫水，浸好蠟的組織于*內進行包埋，石蠟切片機切片，片厚4 μm，HE染色，樹 膠封片供鏡檢。

1. 6. 3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測股骨頭

組織 p-ERK1/2、p-JNK 和 p-p38 蛋白表達 將碎，加入配制好的RIPA裂解液中，然后進行 離心等處理，用 BCA 試劑盒檢測總蛋白含量。 12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白，電轉移至PVDF 膜上，一抗（pERK1/2 1∶2 000 稀釋，p- JNK 1∶1 000 稀釋，pp38 1∶1 000 稀釋，GAPDH 1∶5 000 稀釋）4 ℃過夜 孵育，室溫二抗孵育1 h，ECL化學發光試劑盒顯 影，洗片。膠片經掃描儀掃描后獲得圖像。用 Image J軟件計算目的蛋白條帶與內參GAPDH蛋白 條帶的灰度比值（p）。

1. 7 統計方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據 分析，計量資料以均數 ± 標準差（- x ± s）表示，組間 比較用單因素方差分析，股骨空骨陷窩率（p/%）組 間比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學 意義。

2 結果

2. 1 家兔股骨頭光鏡鏡檢結果

空白組：軟骨細 胞以及骨細胞基質紅染，染色均勻，軟骨細胞排 列規則整齊，組織結構清晰可見，潮線完整。股 骨頭部骨小梁完整無明顯變形、斷裂，排列規 則，骨組織內可見大量活躍的成骨細胞，骨陷窩 稀少，滋養血管豐富，髓腔內可見大量形態規則 的造血細胞，整個組織的結構完整，其中僅可見 極少的脂肪細胞。模型對照組：軟骨細胞破壞明 顯，細胞變形，不規則，整個軟骨層組織排列粗 糙不平整，可見較寬的細胞間隙直達深層組織， 部分動物可見股骨頭軟骨細胞*剝離，軟骨組 織結構模糊不清，潮線明顯中斷。骨組織的骨小 梁變細，稀疏，排列不規則，結構紊亂，骨小梁 之間的間距增寬，骨髓內中可見大量分布的脂肪 細胞，而骨細胞則變形，在組織邊緣聚集， 組織內可見大量骨陷窩存在。川骨片治療組：鏡 下可見關節軟骨輕度變性，軟骨表面細胞排列不 規則，粗糙不整，軟骨下骨組織內可見較豐富的 血管分布，骨組織的四層結構基本清晰，潮線不 連續，鏡下可見少量炎性細胞增生，骨小梁較模 型對照組粗大，骨髓腔內可見造血細胞散在分布，大部分的骨細胞形態結構正常，骨組織內鏡 下可見的空骨陷窩較模型對照組有所減少。仙靈 骨葆膠囊治療組：鏡下可見關節軟骨輕度變性， 軟骨表面細胞排列不規則，粗糙不整，軟骨下骨 組織內可見較豐富的血管分布，骨組織的四層結構基本清晰，潮線不連續，鏡下可見少量炎性細 胞增生，骨小梁較模型對照組粗大，骨髓腔內可 見造血細胞散在分布，大部分的骨細胞形態結構 正常，骨組織內鏡下可見的空骨陷窩較模型對照 組有所減少。

2. 2 各組家兔股骨空骨陷窩率比較

造模組家兔股骨空骨陷窩率明顯高于空白組 （P＜0.05）。表明糖皮質類激素可以導致骨細胞的 破壞，導致空骨陷窩率明顯升高。提示實驗前期 造模成功。第 13 周時，與模型對 照組比較，川骨片治療組、*膠囊治療組 的空骨陷窩率明顯較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；川骨片治療組空骨陷窩率與*膠囊 治療組比較，差異無統計學意義（P > 0.0.5）。

3 討論

目前，激素性股骨頭缺血性壞死（SANFH）的 發病機制仍不明確，存在高凝低纖溶微血管血栓 栓塞學說、脂肪代謝紊亂學說、骨內高壓學說、 二次碰撞學說、遺傳以及基因多態性學說等 。 但股骨頭缺血壞死的發病機制更多集中于分子生 物學水平細胞增殖、分化、凋亡的研究。MAPK通 路在促進細胞增殖、分化、抑制其凋亡中發揮重 要作用。ERK1/2、p38、JNK是MAPK家族的主要 成員。活化的 MAPK 通過級聯反應將外界信號傳 遞給細胞核，通過作用于 AIF-2、cMyc 等轉錄因 子，調節與細胞增殖、分化相關的基因表達。其 中發現的Ras-Raf-MAPK經典信號轉導途徑是 ERK1/2 信號通路，ERK1、ERK2、ERK3、ERK4 和ERK5是它的5個亞組，其中ERK1和ERK2是2 個高度同源的亞類，它們的分子質量分別是 44 kDa和42 kDa，它們在增殖過程中起著重要作用， 卻在分化過程中作用不明顯。Raf家族屬于促分 裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK），當Raf被 激活，其后使 MEK1/2 磷酸化，最終磷酸化激活 ERK1/2。被激活的ERK1/2轉位至核內，引起細胞 生長、增殖與分化。



 

免責聲明：文章僅供學習和交流，如涉及作品版權問題需要我方刪除，請聯系我們，我們會在時間進行處理。