腫瘤是危害健康的常見疾病和多發疾病，目 前臨床上常用的策略主要有手術、、分子 靶向抑制劑以及生物藥療法，常規仍然是臨床治療 腫瘤的主要方式。其中，以5-氟*（5-Fluorouracil，5-FU）為代表的抗代謝類藥在中占據約 40％的比重 。5-FU作為應用的抗代謝類藥， 已在臨床上廣泛用于胃腸道癌、肝癌和胰腺癌等實體 腫瘤的治療，尤其在消化道腫瘤的治療上占據主導地位 。

1 材料

1.1 儀器

Max190全波長酶標儀（美國Spectra公司）；L420離 心機（湘儀離心機儀器有限公司）；TANKPE060 純水儀 （美國 Millipore 公司）；BSA224S-CW 電子天平[賽多利 斯科學儀器（北京）有限公司]；Vortex-5 渦旋混勻儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；EG1150C石蠟包埋 儀（德國徠卡公司）；2000-C倒置顯微鏡、V.A1倒置熒光 顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.2 藥品與試劑

人工蟬花由本實驗室栽培，由南京中醫藥大學藥學院于瑞蓮副教授鑒定為蟬花（Isaria cicadae Miquel）菌 種的人工栽培品；5-FU注射液（天津金耀藥業有限公司， 批號：1605081，規格：0.25 g/10 mL）；大鼠內毒素（ET）酶 聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：H03A8E48592）、D乳酸（D-LA）ELISA試劑盒（批號：H02F4E48101）、分泌型 免疫球蛋白（sIgA）ELISA試劑盒（批號：H13C3E76192）、 腫 瘤 壞 死 因 子 α（TNF-α）ELISA 試 劑 盒（批 號 ： H06A2E50672）、γ-干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒（批號： H06F6E23206）、白細胞介素15（IL-15）ELISA試劑盒（批 號：H03A3F06703）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）ELISA試劑盒（批號：H05A7E46872）、髓過氧化物酶（MPO） ELISA 試劑盒（批號：H03F8E34274）、丙二醛（MDA） ELISA 試劑盒（批號：H04A6E40382）、閉鎖小帶蛋白 ZO-1 ELISA 試劑盒（批號：H03A2E78452）均購自上海 源葉生物科技有限公司；DAPI染色液（南京建成生物有 限公司，批號：SUB- 30162）；兔源緊密連接蛋白Claudin 1-一抗（批號：ab240400）；山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二 抗（批號：ab150077）均購自美國Abcam公司。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠40只，♂，體質量（215±35）g， 由南京市青龍山動物繁殖場提供，動物生產許可證號： SCXK（蘇）2017-0008。所有大鼠飼養于南京中醫藥大 學實驗動物房內，環境溫度為（23±2）℃、12 h/12 h晝夜 循環。飼養期間大鼠自由進食、飲水，適應性飼養1周后 進行實驗。本實驗遵守《實驗動物護理和使用指南》，符 合動物常規倫理。

2 方法

2.1 動物分組與造模

將40只SD大鼠隨機分為正常組、模型組和人工蟬 花高、中、低劑量組，每組8只。除正常組外，模型組和人 工蟬花各劑量組大鼠均每天腹腔注射 1 次 30 mg/kg 的 5-FU，正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，持續注射5 d。在此同時，人工蟬花高、中、低劑量組大鼠在注射 5-FU后1 h分別灌胃3.5 、1.75 、0.875 g/kg的人工蟬花溶 液（將干燥人工蟬花粉末用生理鹽水制備的懸液，劑量 根據預實驗結果和本實驗室前期研究報道設置），正常 組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水；各組大鼠均每天 給藥 1 次，連續給藥 8 d，記錄大鼠體質量等一般情況 變化。

2.2 血清中ET、D-LA含量測定

末次給藥后2 h，大鼠腹主動脈取血，室溫靜置1 h，凝固收縮后，3 000 r/min 離心 10 min，分離血清，然后 于－20 ℃保存，備用。按相應試劑盒說明書操作，檢測 血清中 ET、D-LA 的含量，考察其對小腸黏膜生物屏障 功能的影響。

2.3 血清中sIgA、TNF-α、IFN-γ、IL-15含量測定

取“2.2”項下血清，按相關試劑盒說明書操作，對血 清中sIgA、TNF-α、IFN-γ、IL-15的含量進行測定，考察其 對小腸黏膜免疫功能的影響。

2.4 血清中MPO活性測定

取“2.2”項下血清，按試劑盒說明書操作，對血清中 G-CSF的含量進行測定。大鼠取血后，腹腔解剖取小腸 組織約40 mg勻漿[組織與生理鹽水比為1 ∶ 10（mg/mL）]， 用于試劑盒檢測，剩余部分病理組織檢查待用。按檢測 試劑盒說明書操作，對小腸組織中MPO活性進行測定， 考察其對小腸炎癥因子的影響。

2.5 小腸組織中MDA含量測定

取“2.4”項下小腸組織，按檢測試劑盒說明書操作， 對小腸組織中MDA的含量進行測定，考察其對小腸組 織過氧化水平的影響。

2.6 小腸黏膜病理學觀察

將小腸于10％多聚*固定24 h，然后進行常 規組織包埋、石蠟切片等操作，經蘇木精-伊紅（HE）染色 后顯微鏡下觀察小腸黏膜病理變化。

3 結果

給藥前，各組大鼠間體質量差異均無統計學意義（P＞0.05）。給藥 8 d 后，與正常組比較，模型組大鼠體 質量顯著降低（P＜0.01），此外還出現了明顯的食欲不 振、精神萎靡、活力下降等癥狀。與模型組比較，人工蟬 花高劑量組大鼠體質量均顯著升高（P＜0.01），食欲不 振、精神萎靡等情況也得到明顯改善。與正常組比較，模型組大鼠血清中 ET、D-LA 含量 顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，人工蟬花高、中、 低劑量組大鼠血清中 ET、D-LA 含量均顯著降低（P＜ 0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性趨勢。與正常組比較，模型組大鼠小腸組織中MDA含量 顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，人工蟬花高、中、 低劑量組大鼠小腸組織中 MDA 含量顯著降低（P＜ 0.01），并呈劑量依賴性趨勢。正常組大鼠腸腔絨毛形態完整，隱窩結構清晰。模 型組大鼠腸絨毛剝落明顯，隱窩結構散亂，可觀察到大 量炎性細胞聚集，腸黏膜損傷嚴重。與模型組比較，人 工蟬花高、中、低劑量組大鼠的腸腔絨毛和隱窩結構形 態較完整，損傷程度較小；其中，人工蟬花高劑量、中劑 量組大鼠腸絨毛已接近正常，人工蟬花高劑量組大鼠隱 窩結構較為緊密、完整，人工蟬花低劑量組大鼠小腸組 織隱窩結構雖較正常組有一定程度的破壞、中性粒細胞聚集，但相比于模型組結構仍較好。

4 討論

正常的腸道黏膜屏障由機械屏障、化學屏障、免疫 屏障和生物屏障共同組成。通過對腸黏膜病理切片的 觀察，發現5-FU之后，大鼠小腸絨毛和隱窩結構均 受到了嚴重的損傷，導致腸黏膜屏障功能受到嚴重的影 響，機體無法正常地進行營養吸收，表現為體質量下降 和血清中ET含量顯著升高。D-LA是腸道細菌代謝、裂 解的產物，當腸道缺血時，腸黏膜生物屏障破壞，此時腸 道中細菌產生的大量D-LA，通過受損的腸黏膜經循環 進入血液，檢測血中D-LA水平可以反映腸黏膜受損程 度和通透性變化。本研究結果顯示，模型組大鼠血清 中D-LA含量顯著升高，灌胃人工蟬花后，腸黏膜得到明 顯保護，血清中ET和D-LA含量均顯著降低，并且大鼠 因造成的體質量下降的情況也有顯著的改善，表明 人工蟬花對5-FU后破壞的腸黏膜營養吸收以及腸 黏膜生物屏障有明顯的保護作用。



 

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