1 材料 

1.1 細(xì)胞 

大鼠心肌細(xì)胞株 H9c2（購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心）。 

1.2 藥品與試劑

 附子樣品共 4 批，購自四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)地分別為云南（批號(hào)：HSPYN）、陜西漢中（批號(hào)：HSPSXHZ）、四川江油（批號(hào)：HSPSCJY 和 HSPSCJY1）。新（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110799-201608）；DMEM 培養(yǎng)基（美國 HyClone 公司，批號(hào)：AE）；胎牛血清（美國 Gibco 公司，批號(hào) A10112-2770）；0.25 % 胰 蛋白酶（美國HyClone 公司，批號(hào)：MHE86395）；青、*（美國 Hyclone 公 司，批 號(hào)：AB，J170012）；CCK-8（碧云天生物 技 術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：）；PBS（北京益美源生物科技有限責(zé)任公司，）。 

1.3 儀器 

MCO-15A 型 CO2 培養(yǎng)箱（日本三洋電機(jī)國際貿(mào)易有限公司）；YUETAN 型超凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠）；DT5-6A 型臺(tái)式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；Axioobserver 倒置顯微鏡（德國 ZEISS 公司）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；ME104E 型電子分析天平（瑞士梅特勒 - 托利多公司）；其林貝爾QL-901 型渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶（美國 Corning 公司）

2 方法

附子水提物由中國中藥有限公司制備，制備方法如下：分別稱取黑順片 200 g，浸泡 30 min，煎煮2 次，第 1 次加 9 倍量水，煎煮 30 min，第 2 次加 7倍量水，煎煮 25 min，200 目篩過濾，65℃減壓濃縮，測(cè)定濃縮液密度及干膏得率，冷凍干燥制備成凍干粉備用。4 個(gè)批次（批號(hào)：HSPYN、HSPSXHZ、HSPSCJY、HSPSCJY1）的附子水提物的干膏得率分別為 21.42%、9.85%、8.79% 和 15.26%。附子水提物：精密稱取各批號(hào)附子水提物凍干粉，加入 DMEM *培養(yǎng)基溶解。使用 0.22μm濾膜過濾雜質(zhì)，配制為 0.25 mg·mL-1 附子水提物母液，再用 DMEM *培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)工作濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。新：精密稱取新粉末，加入去離子水溶解，使用 0.22μm 濾膜過濾雜質(zhì)，配制為 18 mg·mL-1 母液。凍存于 -20℃，使用時(shí)加入 DMEM *培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)工作濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。H9c2 細(xì)胞培養(yǎng)于 DMEM 培養(yǎng)基（含 10 % 胎牛血清，100 U·mL-1 青、*，4 mM L- *）中，置于 37℃，5%CO2 及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入 1 mL 0.25% *按照 1：3 比例傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果

結(jié)果顯示，各密度下 H9c2 細(xì)胞在 0 ～ 48 h 為增殖期，48 ～ 60 h 到達(dá)平臺(tái)期，60 ～72 h 進(jìn)入衰亡期。當(dāng)細(xì)胞密度為 2×105/mL 時(shí)，細(xì)胞生長過快，不利于下一步實(shí)驗(yàn)。故選用 0.5×10/mL 或1×105/mL 密度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示附子水提物溶解濃度為250 μg·mL-1，因而選擇給藥濃度 125 μg·mL-1作為藥物測(cè)試濃度；新作為陽性對(duì)照藥，濃度選擇為 100 μg·mL-1。結(jié)果顯 示，當(dāng)細(xì)胞密度為 0.5×105/mL，作用時(shí)間為 12 h 時(shí)，附子水提物和新對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用較強(qiáng)，且作用穩(wěn)定，RSD<15%。故選用 0.5×105/mL，藥物作用 12 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

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