ELISA試劑盒時刻一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔恰當縮短或延伸反響時刻，及時判別。此刻酶催化無色的底物生成有色的產品。反響的溫度和時刻仍是影響顯色的要素。在必定時刻內，陰性孔可堅持無色，而陽性孔則隨時刻的延伸而呈色加強。恰當進步溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反響溫度和時刻應按規則力求。
TMB受光照的影響不大，ELISA試劑盒可在室溫中置于操作臺上，邊反響調查成果。OPD底物顯色一般在室外溫或37 ℃反響20-30分鐘后即不再加深，再延伸反響時刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反響應避光進行，顯色反響結束時加入停止液停止反響。OPD產品用硫酸停止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。但為保證實驗成果的穩定性，宜在規則的恰當時刻閱覽成果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達高峰，隨即逐步削弱，至2小時后即可*消退至無色。TMB的停止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反響停止。這類停止劑尚能使藍色維持較長時刻（12-24小時）不褪，是目視判別的杰出停止劑。
此外，ELISA試劑盒各類酸性停止液則會使藍色轉變成黃色，此刻可用特定的波長（450 nm）測讀吸光值。比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，ELISA試劑盒然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的實驗，需先將板置于規范96孔的座架中，才可進行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊際剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。