ToneScript cDNA*鏈合成試劑盒是專門用于兩步法RT-PCR的*步，含有合成高質量*鏈cDNA所需的所有成分，適用于后續的PCR、qPCR以及基因克隆。那么在實際操作中會有哪些常見問題呢？一起來了解一下：

1、 沒有RT-PCR產物或產量低

◆RNA模板降解。RNA 的純度和完整對于反轉錄得到全長cDNA是非常重要的。提取的RNA應進行電泳檢測以確定其是否降解。同時RNA要避免多次反復凍融。

◆RNA模板純度低。提取RNA的過程中，可能殘留一些鹽離子、試劑，如 EDTA、酚、胍鹽、磷酸鹽、多胺等抑制接下來的反轉錄反應。建議用75%乙醇（DEPC 水配制）仔細清洗RNA沉淀。

◆引物不合適。選擇合適的引物，當RNA是細菌RNA或者是沒有polyA尾的RNA要選擇隨機引物或者特異引物。

◆目的基因含有復雜二級結構或高GC含量。建議選擇隨機引物進行反轉錄。將反轉錄溫度提高至55℃。

2、RT-PCR 產物比預期長

◆RNA 中很可能污染了DNA。真核生物基因組DNA中含有內含子，可能參與了 PCR擴增，可以在反轉錄之前對RNA進行DNaseI的消化。

3、陰性對照中有RT-PCR產物

◆陰性對照中有RT-PCR產物也表明有DNA的污染。在反轉錄之前對RNA進行DNase I 的消化。