早期細胞凋亡檢測及活細胞的胞膜正常，DNA染料碘化丙錠(PI)拒染，但可被另外一種DNA染料Hoechst342(Ho342)染色；而壞死細胞的胞膜完整性受到破壞，細胞不需固定即可被PI染色。凋亡細胞的胞膜成分亦發生改變，在凋亡早期，原來位于細胞膜內側的磷脂酰*(PS)遷移至脂雙層外側。另外，細胞凋亡時核酸內切酶被激活，首先將DNA切成50～300kb大小的DNA，然后進一步將染色質裂解成單個核小體和寡聚核小體，形成180～200bp的DNA。而壞死細胞DNA斷裂無規律性。

本文綜述了細胞凋亡的生物化學檢測方法。
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一、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測方法
原理：在正常細胞中，磷脂酰*只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發生凋亡早期，膜磷脂酰*（PS）由脂膜內側翻向外側，這一變化早于細胞皺縮、染色質濃縮、細胞膜的通透性增加等凋亡現象。

AnnexinV是一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰*有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰*與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。 

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但凋亡中晚期的細胞和死細胞由于細胞膜通透性的增加，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。 

因此，將Annexin V與PI聯合使用時，PI 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI 結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/PI+）。

檢測方法：1.按照既定程序誘導細胞凋亡；2.按照說明書配制所需溶液；3.常規制備單細胞懸液，用冷PBS洗兩次后，取約5×106個細胞，1500rpm離心，棄上清，將細胞懸浮在400 µl×結合溶液中；4.將細胞懸液分成5管，每管約1×106個細胞，陰性對照管不加任何試劑，陽性對照管加2%多聚甲醛固定30分鐘，用FITC標記Annexin V和PI雙染，余下3管，其中1管只加10 µl PI，1管只加5 µl FITC標記Annexin V，后一管加10 µl PI和FITC標記Annexin V混合，室溫孵育15分鐘；5.每管各加400 µl 1× 結合緩沖液上機檢測。

注意事項：A.確定細胞凋亡發生的時間，PS外翻只發生在細胞凋亡早期，建議先觀察細胞凋亡的形態后決定取樣檢測時間；B.由于EDTA會絡合Ca2+離子，影響Annexin V與PS的結合，因此建議不用含EDTA的*消化貼壁細胞。細胞凋亡檢測經過*消化后可能導致*對細胞的進一步作用從而導致細胞的進一步凋亡，建議在用*處理前單獨收集培養液中懸浮的細胞，保存在2%的BSA中。
 
二、磷脂酰*單抗（PS）檢測法
原理：與Annexin V相比，PS的抗體可以直接用來檢測細胞凋亡過程中PS的外翻，而且靈敏度高，特異性強，信號持續時間久，費用更低。
 
三、TUNEL法
原理：TUNEL的全稱是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名為末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP原位切口末端標記。

細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca ²+和Mg²+依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或*形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。

TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

不足之處：
(1)壞死細胞亦有DNA裂點形成,也可呈現TUNEL反應陽性，因而特異性較差。據報道，TUNEL反應中壞死細胞的標記量比凋亡細胞的標記量少一個數量級。
(2)TUNEL結合免疫組化檢測時，細胞凋亡檢測固定過程對檢測的影響較大，切片的大小、薄厚會直接影響到固定效果，從而產生結果的差異。