干細(xì)胞轉(zhuǎn)染的開始——在轉(zhuǎn)染前12小時(shí)，將細(xì)胞分種于培養(yǎng)板中。在細(xì)胞達(dá)到50-80%的融合率時(shí)開始轉(zhuǎn)染，這樣就可以使它們?cè)趯?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到接近的融合。細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在0.5-6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成。

轉(zhuǎn)染是否成功的影響因素很多，如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型（對(duì)于困難的細(xì)胞系尤其如此），需要被轉(zhuǎn)染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì)），轉(zhuǎn)染試劑等。但無(wú)論在何種情況下，轉(zhuǎn)染的成功均取決于轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性以及重現(xiàn)性這幾個(gè)要素。以下是幫大家搜集的關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一些時(shí)間方面的問(wèn)題及解答。

了解一下大家做細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)的幾個(gè)小細(xì)節(jié)：

1、對(duì)于293、293T這種貼壁不是很緊的細(xì)胞系，大家都是分了細(xì)胞之后多長(zhǎng)時(shí)間做轉(zhuǎn)染呢？或者細(xì)胞長(zhǎng)到那種密度做轉(zhuǎn)染呢？

2、轉(zhuǎn)染之后大家都是多久收細(xì)胞呢？或者是多大密度收細(xì)胞呢？

3、轉(zhuǎn)染之后的細(xì)胞如果很長(zhǎng)時(shí)間不收，例如48h~72h不收細(xì)胞，轉(zhuǎn)進(jìn)去的外源基因還有沒(méi)有表達(dá)呢？表達(dá)量怎么樣呢？

答：1, 鋪板24-48轉(zhuǎn)染 主要看你鋪的密度 想24H的話可以1W每孔

     2，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染24H夠了，不過(guò)我們做的時(shí)候不收細(xì)胞，直接做flipr

     3, 48H還沒(méi)神馬問(wèn)題的，72就不知道了

問(wèn)：想在鋪板之后16h或者更短的時(shí)間內(nèi)做轉(zhuǎn)然可以嗎？用的是維格拉斯的VigoFect脂質(zhì)體？

答： 細(xì)胞鋪的密一點(diǎn)就行了，轉(zhuǎn)染的時(shí)間根據(jù)細(xì)胞的密度吧，我一般5000細(xì)胞每孔種入24孔板。待細(xì)胞長(zhǎng)到60——70%的時(shí)候開始轉(zhuǎn)染，這個(gè)看細(xì)胞系，有的細(xì)胞長(zhǎng)的快，種完后需要的時(shí)間短些。轉(zhuǎn)染完后我們做luciferase，都是24小時(shí)后收取細(xì)胞。

對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，一般在細(xì)胞中期轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率會(huì)相對(duì)高一些。這個(gè)時(shí)候的細(xì)胞狀態(tài)是的。對(duì)于HEK293T來(lái)說(shuō)，一般轉(zhuǎn)染的時(shí)間是在傳代后24hr以內(nèi)。轉(zhuǎn)染后48hr，外源基因肯定是有表達(dá)的。至于72hr，應(yīng)該也還是有表達(dá)的，可能表達(dá)量會(huì)很低，主要是這個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞大部分都衰老了。建議293T收集細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后36-48hr收集。

時(shí)間進(jìn)度

一般原則提示：要確保zui終結(jié)果的成功；建立一個(gè)合適的時(shí)間進(jìn)度進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以保證您所需要的目的蛋白能得到表達(dá)。

轉(zhuǎn)染的開始——在轉(zhuǎn)染前12小時(shí)，將細(xì)胞分種于培養(yǎng)板中。在細(xì)胞達(dá)到50-80%的融合率時(shí)開始轉(zhuǎn)染，這樣就可以使它們?cè)趯?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到接近的融合。細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在0.5-6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成。在這段時(shí)間后，就不會(huì)再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所增長(zhǎng)。

培養(yǎng)基更換——某些轉(zhuǎn)染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基。如果轉(zhuǎn)染必須在沒(méi)有胎牛血清存在的條件下進(jìn)行，那么這一步驟就*。而對(duì)于可在血清存在的情況下使用的無(wú)毒性轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達(dá)階段，就可以省略這一步。

如果將轉(zhuǎn)染復(fù)合物留在培養(yǎng)基中直到進(jìn)行檢測(cè)，那么對(duì)有些細(xì)胞系而言轉(zhuǎn)染效率會(huì)有所提高，而另外一些細(xì)胞在轉(zhuǎn)染開始幾個(gè)小時(shí)之后其轉(zhuǎn)染效率就不會(huì)再有升高。雖然在轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)染劑/DNA復(fù)合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中清除，但在此后的*生長(zhǎng)階段換用新鮮的培養(yǎng)基卻是必須的。如果轉(zhuǎn)染細(xì)胞需要生長(zhǎng)3-7天，換培養(yǎng)基就尤其重要，這樣一來(lái)就使它們有時(shí)間達(dá)到zui高的蛋白表達(dá)量。

時(shí)間測(cè)定——轉(zhuǎn)染開始后的24-48小時(shí)內(nèi)，干細(xì)胞報(bào)告基因產(chǎn)物的濃度逐漸增加；而這種增加取決于增強(qiáng)子的強(qiáng)度、表達(dá)外源蛋白中所涉及的細(xì)胞反應(yīng)，存活細(xì)胞的健康狀態(tài)，以及營(yíng)養(yǎng)因素等。在轉(zhuǎn)染后等待3-7天收集蛋白進(jìn)行純化較為常見了。

zui后就是平時(shí)可能會(huì)忽略的轉(zhuǎn)染試劑本身的脫靶效應(yīng)off-target effect，轉(zhuǎn)染試劑本身對(duì)基因表達(dá)水平（高表達(dá)或低表達(dá)）的影響，有時(shí)候可能會(huì)造成假陽(yáng)性的結(jié)果。
供HPLC法系統(tǒng)適用性    50mg    *雜質(zhì)Ⅰ    常溫，避光    *：    規(guī)格:
供鑒別用    100mg    *    常溫，避光    *：    規(guī)格:
供檢查用    50mg    反式*    常溫，避光    *：    規(guī)格:
供檢查用    50mg    去氟*    常溫，避光    *：    規(guī)格:
供檢查用    50mg    N-甲基*    常溫，避光    *：    規(guī)格:
供檢查用    50mg    4-羥基間苯二甲酸    常溫，避光    *：    規(guī)格:
供GC法含量    50mg    *    常溫，避光    *：    規(guī)格:
供檢查用    50mg    二*    常溫，避光    *：    規(guī)格:
供GC法含量    100mg    間甲酚    常溫，避光    *：    規(guī)格:
干細(xì)胞