小鼠肝星狀細胞永生化細胞專用培養(yǎng)基操作步驟：

在完成培養(yǎng)基配制后，需進行無菌分裝至培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，避免長時間暴露于空氣中。分裝時建議在超凈工作臺內(nèi)操作，使用0.22 μm濾膜過濾后的培養(yǎng)基可進一步降低污染風險。若需長期保存，可分裝為50 mL/管，置于4℃避光儲存，建議兩周內(nèi)使用完畢，以維持營養(yǎng)成分的穩(wěn)定性。

接種永生化的小鼠肝星狀細胞前，需先用預熱的PBS輕柔洗滌細胞2-3次，以去除殘留的血清或消化酶。采用0.25%（含EDTA）在37℃下消化30-60秒，加入含血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，離心后重懸細胞，調(diào)整密度至5×10?~1×10? cells/mL。接種時注意均勻鋪板，避免局部堆積影響細胞貼壁。

培養(yǎng)條件需嚴格控制在37℃、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，濕度維持在90%以上。換液建議在接種后24小時進行，此后每48-72小時更換一次新鮮培養(yǎng)基。若細胞密度超過80%，需及時傳代，傳代比例通常為1:2至1:3，以保持細胞良好的增殖狀態(tài)。

為監(jiān)測細胞狀態(tài)，可定期在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)：永生化肝星狀細胞應(yīng)呈現(xiàn)梭形或多角形，胞質(zhì)透亮，偽足明顯。若出現(xiàn)顆粒增多或收縮圓化，可能提示培養(yǎng)環(huán)境異常。必要時可通過α-SMA免疫熒光染色或CCK-8增殖實驗進一步驗證細胞活性。

**注意事項**：

1. 避免反復凍融培養(yǎng)基，分裝后標注配制日期；

2. 傳代時消化時間不宜過長，防止細胞損傷；

3. 培養(yǎng)過程中出現(xiàn)污染需立即廢棄并消毒操作區(qū)。

通過上述標準化操作，可確保永生化肝星狀細胞的穩(wěn)定生長，為后續(xù)肝纖維化機制研究或藥物篩選提供可靠模型。