ATCC細胞培養(yǎng)之成纖維細胞排除法

1.機械刮除法：

是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為：

(1)標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位;

(2)刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間;

(3)用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞;

(4)注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞殘留，可重復(fù)刮除至*除掉為止

2.反復(fù)貼壁法：

根據(jù)腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。

(1)待細胞生長達一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液;

(2)取編號為此A、B、C三個培養(yǎng)瓶;首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后;向A瓶中補充少許*培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng);

(3)培養(yǎng)B瓶中細胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中;再向B瓶中補加*培養(yǎng)基。

當三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復(fù)處理多次，直至癌細胞純化為止。

3.消化排除法：

此法曾用于乳癌細胞的培養(yǎng)，具體程序是：

(1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1：1)混合液漂洗培養(yǎng)細胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細胞脫落下來后，便立即停止消化;

(2)把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng);向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細胞除凈。

4.膠原酶消化法：

本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。

(1)可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當發(fā)現(xiàn)成纖維細胞被除掉后，即終止消化;

(2)用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復(fù)。

5.其它方法：

有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用;也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細胞懸液后，在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細胞，在比重1.050～1.085層為上皮細胞，再經(jīng)過分離進行培養(yǎng)。Z近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細胞生長的方法。

選用上述任何一種方法，都需進行試驗，取得必要經(jīng)驗，找出適合的條件，才能獲得好的效果。

(三)提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率措施

根據(jù)人們的經(jīng)驗，ATCC細胞培養(yǎng)在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養(yǎng)后，常出現(xiàn)以下幾種情況：*無細胞游出或移動;有細胞移動和游出，但無細胞增殖，細胞長時間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代;有細胞增殖，傳若干代后停止生長或衰退死亡;傳數(shù)代后細胞增殖緩慢，經(jīng)過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態(tài)，形成穩(wěn)定生長的腫瘤傳代細胞系。

以上現(xiàn)象說明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求，并需經(jīng)過對新環(huán)境的適應(yīng)才能生長，因此欲獲得好的培養(yǎng)效果，不能局限于一般培養(yǎng)法，必須采用一些特殊的措施。
(肼基羰基)二茂鐵(>95.0%(HPLC)(T),用于液相色譜標記)    英文名稱：    (Hydrazinocarbonyl)ferrocene    質(zhì)量規(guī)格：    >95.0%(HPLC)(T),用于液相色譜標記            號：    12153-28-5    
(氯甲基)三乙氧基硅烷(>95.0%(GC))    英文名稱：    (Chloromethyl)triethoxysilane    質(zhì)量規(guī)格：    >95.0%(GC)            號：    15267-95-5    
(順式)氟伏沙明    英文名稱：    (Z) Fluvoxamine    質(zhì)量規(guī)格：    美國進口            號：    917096-37-8    
(溴甲基)二甲基氯硅烷(>95.0%(GC))    英文名稱：    (Bromomethyl)chlorodimethylsilane    質(zhì)量規(guī)格：    >95.0%(GC)            號：    16532-02-8    

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