SHG-44細(xì)胞的轉(zhuǎn)染操作方法

(1) 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，加入脂質(zhì)體/ DNA混合物之前的短時(shí)間內(nèi)，更換1ml新鮮的有血清或無血清培養(yǎng)基。

(2) 準(zhǔn)備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個(gè)細(xì)胞系的比例。① 溶液A：用HBS稀釋DNA(pcDNA3、重組pcDNA3)各1.5μg 到總體積50μl(30μg/ml)。②溶液B：用HBS稀釋6μl脂質(zhì)體到終容積50μl(120μg/ml)。③混合溶液A和B，輕柔混合(不要振蕩)，室溫孵育15min，以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。

(3) 不要移去培養(yǎng)基，逐滴加入100μl 脂質(zhì)體/DNA混合物(從培養(yǎng)孔一邊到另一邊)，邊加邊輕搖培養(yǎng)板。

(4) 37℃孵育6hr。

(5) 6hr后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入2-3ml新鮮生長培養(yǎng)基。

(6) 轉(zhuǎn)染24hr后施加篩選壓力，改用含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

4、 G418篩選：在G418篩選濃度下持續(xù)培養(yǎng)14天后，挑出單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3即SHG-44-vect，并設(shè)對照組細(xì)胞系即SHG-44。

篩選結(jié)果鑒定：

(1)基因組DNA提取→PCR鑒定外源基因

(2)SHG-44-重組pcDNA3陽性細(xì)胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝膠電泳→免疫印跡鑒定P16蛋白表達(dá)(Western-blot)。

(3)測定外源性基因?qū)HG-44細(xì)胞增殖的影響

①流式細(xì)胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→單細(xì)胞懸液→70%酒精固定→裂解細(xì)胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機(jī)分析G1期和G2/M、S期比例。

②細(xì)胞生長曲線測定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→5×104/孔接種24孔培養(yǎng)板→24hr后各自用苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞→計(jì)算細(xì)胞生長抑制百分率。

③軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→104 細(xì)胞→0.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)→1-2周后計(jì)數(shù)不可少于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)→計(jì)算克隆形成率抑制率。

注意事項(xiàng)

1、優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件(脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時(shí)間)每種細(xì)胞和質(zhì)粒均須進(jìn)行。用于轉(zhuǎn)染的核酸應(yīng)高度純化。為避免微生物污染，所用溶液濾過滅菌，以及隨后的使用應(yīng)在無菌條件下，這是細(xì)胞慣常的做法。但是，脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA混合物無需濾過除菌。

2、預(yù)備脂質(zhì)體/DNA混合物必須在無血清下進(jìn)行。但是在隨后的脂質(zhì)體/ DNA與被轉(zhuǎn)染細(xì)胞共孵育的過程中，血清又是培養(yǎng)基的一部分。

3、細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染之前更換培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率，但所用培養(yǎng)基必須37℃預(yù)溫。

脂質(zhì)體/ DNA混合物應(yīng)當(dāng)逐滴加入，盡可能保持一致，從培養(yǎng)皿一邊到另一邊，邊加入邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。